新城疫病毒血清学血凝抑制测定抗原制备的优化

我们的研究重点是优化血凝抑制测定的抗原制备。为了提高 NDV 抗体检测的准确性，我们提供了一种快速准确地制备 4-HAU 抗原溶液的方法。HI 检测仍然是 NDV 抗体检测的最常用方法。

然而，新技术，包括自动液体处理系统、高通量血清学平台和先进的成像工具，也可以集成到 HI 检测中。它们能够实现更快、更准确的分析，尤其是在处理大批量时。我们建立了一种有效的方法，可以更准确地检测抗原储备液的 HA 滴度，并结合严格的返滴定方法和明确的调整过程。

这种方法提供了一种准确的方法，最大限度地减少了计算任务，提高了测试效率和可靠性，并有助于改善家禽种群的疾病监测和控制。鸡红细胞悬液和 HA HI 结果的视觉读数仍然有助于变异性。我们的实验室将专注于标准化 RBC 悬液，并探索计算机视觉或其他方法将 HA HI 检测结果数字化，减少主观性并提高一致性。

首先，将 3 毫升 Alserver 溶液加入无菌 15 毫升锥形离心管中。从三只非免疫鸡的翼静脉中采集一毫升血液。然后，立即将收集的血液转移到抗凝管中，并通过倒置轻轻混合内容物。

用无菌 PBS 填充试管，使总体积达到 12 毫升。轻轻混合溶液，以确保组分均匀分布。然后，将试管放入配备水平转子的离心机中，以 500 G 离心 10 分钟。

离心后，小心地从试管中取出上清液和白细胞层。使用移液管将 1 毫升 RBC 沉淀倒吸到 99 毫升无菌 PBS 溶液中，以制备 1% RBC 悬浮液。要重建冻干抗原，请将 2 毫升无菌 PBS 添加到含有它的安瓿瓶中。

轻轻摇晃安瓿瓶，使内容物完全溶解，静置 2 至 3 分钟，以减少气泡形成。将复溶溶液分装到 1.5 mL离心管中，并将其储存在零下 20 摄氏度的冰箱中直至使用。首先，将 40、80、120 和 160 微升 PBS 分别分配到一次性 96 孔 V 形底微量滴定板的四个相邻孔中。

向每个孔中加入 20 微升重构的抗原，并上下移液 10 次以产生稀释。然后，清楚地标记新的微量滴定板以进行后续步骤，并将 25 微升 PBS 分配到第 1 行至第 5 行的每个孔中。使用多通道移液器，将 25 微升稀释的抗原溶液放入第 1 行至第 5 行的第一个孔中。

上下移液内容物至少五次，以确保均匀分布。然后，将 25 μL 从每行的第一个孔转移到第二个孔中，充分混合。丢弃第 25 列后的最终溶液第 11 微升。

接下来，从抗原浓度最低的孔开始，分别向每个孔中加入 25 微升 PBS 和 1% 鸡 RBC 悬浮液。将微量滴定板放在微孔板摇床上充分混合。将板在室温下放在工作台上约 30 分钟，以使第 12 柱中的 RBC 完全沉降。

使用此处所示的公式计算制备 4-HAU 抗原溶液的稀释因子。使用给定的公式确定所需 4-HAU 溶液的总体积以及抗原储备溶液和 PBS 的所需体积。使用移液管，将计算体积的 PBS 转移到容器中。

加入相应体积的抗原原液并充分混合以制备 4-HAU 抗原溶液。然后，将 25、50、75、100、125 和 150 μL PBS 分配到微量滴定板的 6 个相邻孔中。向每个孔中加入 25 微升 4-HAU 抗原溶液，并上下移液 10 次以确保适当稀释。

使用多通道移液器，将 25 微升每种稀释的抗原溶液从第一行转移到另一行的孔中。然后，向每个孔中加入 25 微升 PBS，然后在每个孔中加入 25 微升 1% 鸡 RBC 悬浮液。将板放在微孔板振荡器上约 20 秒，以充分混合内容物。

仔细观察孔中的血凝模式，并记录结果。