血浆来源的细胞外囊泡的分离、表征和蛋白质组学分析用于心血管生物标志物的发现

循环细胞外囊泡作为生物标志物是生物标志物研究中一个相对较新的领域，具有巨大的潜力。我们的协议旨在提供一种动手实践方法，以在急诊科环境中实施细胞外囊泡结合生物标志物的发现和检测。新出现的证据表明，在细胞外囊泡和循环中发现的分子货物包含多种疾病背景下感兴趣的蛋白质和 RNA。

几种新的细胞外囊泡、封闭的生物标志物与各种心血管疾病实体的诊断和预后有关。循环细胞外囊泡生物标志物发现领域的主要挑战是细胞外囊泡的保存和依赖于 EV 释放动力学的血浆采集。因此，有必要在临床常规中嵌入严格的方案，以避免 EV 降解并保持可重复的结果，尤其是在应用蛋白质组学等大规模分析方法时。

循环 EV 中蛋白质生物标志物的发现在很大程度上取决于相对于症状发作的初始采血时间，以及由于 EV 自然降解而导致的样本储存时间。该方案提供了血浆 EV 分离和引入蛋白质组学分析的动手方案，以集成到急诊科的临床工作流程中。我们即将进行的研究将侧重于将不同的患者群体整合到我们的方法中，其中包括失代偿性心力衰竭、心律失常或心动过速心肌病患者，以及接受搭桥手术的患者的纵向研究。

使用该协议，我们旨在确定有助于上述病理诊断和预后的新型 EV 结合生物标志物。要开始离心人血浆，请使用带有固定角转子的超速离心机而不会破裂。碎片和凋亡小体沉淀后，将上清液转移到新试管中，并在 4 摄氏度下以 100， 000 G 超速离心 2 小时而不破裂，以分离细胞外囊泡。

超速离心后小心取出试管。使用电动移液管轻轻吸出上清液，留下大约 1 毫升细胞外囊泡耗尽的血浆。切换到 1000 微升移液器，小心地移取剩余的血浆，而不会干扰细胞外囊泡沉淀。

在移液过程中逐渐倾斜试管以确保没有血浆残留，并将沉淀重悬于 PBS 中。接下来，用冰冷的 PBS 以不同的比例稀释细胞外囊泡原液，以在跟踪过程中达到每帧 10 至 100 个纳米颗粒的最终计数范围。打开 NTA 仪器并在连接的计算机上启动适用的软件。

将腔室插入激光棺材，然后单击启动相机以激活它。将 1 毫升 PBS 吸入注射器中，并将其连接到前管。彻底冲洗管道系统，确保腔室中没有气泡。

监控摄像头以检测任何气泡或污染颗粒。现在将准备好的细胞外囊泡工作稀释液吸取到 1 毫升注射器中，并将其注射到腔室中。转到捕获和处理选项卡以调整屏幕增益以匹配显示器的亮度。

修改相机级别以增强屏幕上的纳米颗粒区分。在 process 选项卡中设置适当的检测阈值，以区分颗粒和背景噪声。使用调焦轮将相机聚焦在仪器的每一侧，直到纳米颗粒在屏幕上出现清晰。

在硬件设置中为所有测量设置 22 摄氏度的恒定温度后，单击运行按钮开始测量。每次样品运行至少录制三个视频，每个视频 30 秒。单击更改以输入样品稀释因子，最后单击导出以保存结果。

使用纳米颗粒跟踪分析，根据布朗尼和运动识别和可视化细胞外囊泡。分析显示，健康个体血浆中的平均颗粒浓度为 1.2 乘以 10 到 10 次方/毫升，表明存在细胞外囊泡。血浆细胞外囊泡的平均尺寸测量为 184.7 纳米，与典型的细胞外囊泡尺寸一致。