开发用于检测SARS-CoV-2、甲型/乙型流感和MERS-CoV的多重实时RT-qPCR检测

该检测的总体目标是管理一种多重方法，用于同时检测常见传播的呼吸道病毒，如 SARS-CoV-2、MERS、甲型流感和乙型流感.推动我们领域进步的主流技术包括 CRISPR、侧向流氨基检测、基于纸张的生物分子传感器、一锅中的夏洛克测试、DNA 适配体和与环介导的等温扩增相结合的多重 RT-qPCR， 灯。然而，多重 RT-qPCR 是最敏感、最常见的，是诊断各种病毒的金标准。目前的实验挑战是建立一种可用于检测低至 10 拷贝的 RNA 拷贝的方案。

我们使用内部 RT-qPCR 试剂盒进行检测，既省时又省钱。首先，在不含 DNA/RNA 的水中制备用于 RT-qPCR 的 2x 缓冲液将缓冲液储存在零下 20 摄氏度直至进一步使用。接下来，将引物和探针混合在 1.5 毫升试管中。

用洗脱缓冲液补足体积，然后将试管储存在零下 20 摄氏度。在冰上的 1.5 毫升试管中制备含有 taq 聚合酶和 MMLV-RT 的酶混合物。用 taq 聚合酶储存缓冲液补足体积。

现在用 100 微升 Tris-EDTA 缓冲液将病毒合成的 RNA 重悬于单独的试管中，以制备每微升 10 至 6 个 RNA 拷贝的储备液。为了混合病毒原液，将 SARS-CoV-2、甲型流感和乙型流感各 5 微升添加到 50 微升 Tris-EDTA 缓冲液中。同样，混合 SARS-CoV-2 和 MERS-CoV 以获得第二种病毒混合物。

将两种混合物稀释 10 倍，以获得每微升 10 个 RNA 拷贝的最终稀释度。向 96 孔板的每个孔中移液 2x 缓冲液、引物、酶、不含 DNA/RNA 的水以及相应的 RNA 混合物。用粘性板密封件密封板。

然后将板离心 1 分钟，以收集孔底部的液体。接下来，对 PCR 机进行编程以接受快速 96 孔模块类型，并将实验类型设置为标准曲线。将试剂设置为 TaqMan reagents，然后选择标准运行属性。

定义基因靶标和报告基因染料。然后定义每个待测反应的样品名称，并将靶标和样品分配给板布局。现在将循环程序输入仪器。

将板以正确的方向转移到实时 QPCR 机器上，然后按 run 开始循环。选择文件位置以保存实验数据。然后检查 QPCR 程序提供的扩增曲线。

开发的两种试剂盒能够成功同时扩增所有三个靶基因，每个反应的 RNA 拷贝数低至 10 个。所有病毒滴定的扩增效率均在 99% 以上