丝状蓝藻延时显微镜分析的垂直固定方法

在细菌中，研究细胞分裂蛋白的动力学需要细胞的空间方向。例如，在细菌细胞分裂的主要成分Z环的情况下，垂直方向是记录XY平面中整个结构的基础。在本视频中，我们开发了一种在丝状蓝藻Anabaena中实现这种特定取向的方法。

Anabaena是一种多细胞光合生物，与其他细菌共享使用大气氮作为氮源的能力。在没有这种元素的情况下，Anabaena分化专门从事固氮的细胞。因此，它提供了一个很好的模型来分析细胞分裂和多细胞之间的关系。

首先，选择存在于目标丝状蓝藻菌株中的分裂成分。对于实验，有必要构建一种丝状蓝藻突变体，该突变体表达与荧光蛋白融合的所选分裂体成分。在该协议中，我们使用表达与GFP融合的FtsZ的Anabaena突变体为例。

首先，用10毫升固定相培养物和90毫升液体培养基制作突变体的新鲜传代培养物。然后在恒定的光照和最佳温度下生长新的细胞培养物，直到达到指数期。在我们的例子中，突变体在25摄氏度下生长了七天。

现在取两毫升生长培养物并将其放入离心管中。在室温下以2， 500 x g 离心10分钟。离心后，检查所有细胞是否都在管底部。

处理样品时要小心，以免重新悬浮。在微波炉中加热3%低熔点琼脂糖溶液。重要的是在短时间内执行此操作，并检查溶液直到完全液态。

融化后，放在一边冷却。取上一步的离心管，弃去1.9毫升上清液，上下移液至少三次将细胞重悬于剩余体积中。在您的工作场所，将带有细胞的管子，融化的琼脂糖溶液，在尖端切开的一毫升注射器以及带有新干净刀片的手术刀。

然后通过移液至少三次将细胞与900微升3%琼脂糖溶液混合。确保琼脂糖溶液不太热，但保持液态非常重要。有了这个，我们可以避免在此过程中的细胞损伤。

下一步必须在琼脂糖溶液凝胶化之前快速完成。小心地将琼脂糖基质吸入一毫升注射器中。重要的是避免在吸吮样品时产生气泡。

之后，孵育样品，将注射器在室温下水平放置两个小时。孵育后，使用柱塞在干净平坦的表面上小心地除去带有细胞的基质。使用手术刀将凝胶样品切成尽可能薄的切片，保持基质的完整性。

然后将样品并排存放在相应的盖玻片中。如视频所示，在此步骤中，您可以使用吸头来协助样品的处理过程。对于延时实验，建议使用用于显微镜分析的细胞室。

在这种情况下，我们使用适合这些类型腔室的圆形盖玻片，如您在视频中看到的那样。最后，为防止样品脱水，在腔室内添加额外体积的融化的3%琼脂糖溶液。成像前，等到琼脂糖完全凝胶化。

现在将装有细胞的腔室放入显微镜中进行成像。建议使用具有温度和湿度控制功能的设备。以最大放大倍率在明场中可视化样品，并搜索垂直方向的灯丝。

您可以使用沿Z平面的自发荧光信号进行初始扫描，找到感兴趣的分裂位点。有了这个，使用荧光蛋白标记物的参数来可视化您感兴趣的蛋白质在分裂位点的信号。现在，您可以根据生物模型和感兴趣的蛋白质进行延时实验。

在这种情况下，我们可以看到 Z 平面中 FtsZ-GFP 突变体中 Z 环的整个结构。通过我们的方法，我们能够在很长一段时间内记录这些环的动力学。最后，随着荧光强度的变化，我们得出结论，这种结构在我们的模型中是高度动态的。

该方法是一种快速且廉价的方案，以Anabaena为模型，通过应用于丝状蓝藻等复杂形态的共聚焦显微镜来记录分裂位点中的蛋白质动力学。