使用组合的 Cre-LoxP、CRISPR-Cas9 和腺相关病毒单向导 RNA 系统生成棕色脂肪特异性敲除小鼠

该协议使用Cre-LoxP，CRISPR-Cas9和腺相关病毒单向导RNA系统生成棕色脂肪特异性敲除小鼠。它包括一种手术技术，可以安全地将AAV注入棕色脂肪中。该技术的主要优点是它可以快速产生组织特异性敲除，而无需选择性地繁殖小鼠。

如果根据靶器官修改注射AAV的外科手术，则进行组织特异性敲除或敲除的方法可以适用于其他组织。首先，将镇痛药皮下施用到麻醉的UCP1 Cre Cas9小鼠中，以尽量减少和预防术后疼痛和痛苦。然后使用剃须刀在其肩胛间区域剃除皮毛，并用至少三轮交替使用碘基或氯己定基磨砂膏对手术区域进行消毒，然后用 70% 乙醇。

使用手术刀，在肩胛骨之间的棕色脂肪组织上方的皮肤上切开一个两厘米的切口，以暴露肩胛间脂肪。做一个切口后，在脂肪组织和肌肉的远端区域之间的边界上切割脂肪组织。然后用惯用手的手术剪刀，将脂肪组织钝地垂直剥开，露出棕色脂肪组织，同时用非惯用手捏住脂肪组织，包括棕色脂肪组织。

使用苏尔寿静脉作为标志来指示精确的棕色脂肪组织位置。接下来，对于每只小鼠，使用连接到100微升汉密尔顿注射器的锋利32号针头将20微升腺相关病毒或AAV缓慢注射到两个棕色脂肪组织的每个叶中。确认成功注射，表明在AAV给药期间注射部位没有泄漏。

确保稳态后，将暴露的脂肪组织放回正常位置，使用5-0可吸收单丝线缝合脂肪组织和肌肉的边缘。最后，用 5-0 涂层 VICRYL 未染色的编织线缝合开放的皮肤。如果不暴露棕色脂肪组织，就无法确定其精确位置，但是，过度暴露对组织的损害。

可能导致注射失败的潜在缺陷包括将AAV溶液注射到不正确的区域，针头穿透组织以及由于AAV溶液体积过大而导致组织膨胀。将AAV单向导RNA精确递送到棕色脂肪组织对于该方案的成功至关重要。暴露棕色脂肪组织时成功的关键是手术剪刀技术，包括剪刀的方向和深度，以及汉密尔顿注射器的位置。

该技术具有产生负荷的组织特异性敲除动物，以了解棕色脂肪相关能量代谢的分子调节因子。