马骨骼肌的高分辨率氟呼吸测定法

这些协议允许研究人员超越简单地测量线粒体耗氧量，而是允许测量关键的线粒体最终产物，ATP和活性氧。该技术的主要优点是，研究人员可以通过直接比较耗氧率与最终产品生产率来测量线粒体效率。最终产品是ATP还是活性氧。

这些技术需要非常仔细地注意细节，特别是在避免气泡方面。无论是在呼吸室还是滴定注射器中，气泡都是您的敌人，因为它们会使测量变得不那么精确。获得骨骼肌活检后。

用无镁培养基填充呼吸计室并密封培养室。将仪器孵化温度设置为 38 摄氏度，以表示马骨骼肌的基础温度。并使用呼吸计室底部的磁力搅拌将呼吸介质的混合设置为750 rpm。

接下来，关闭腔室照明以避免干扰荧光传感器。用 800 毫伏极化电压为氧电极通电，并以增益设置为 1 放大产生的信号。每两秒记录一次氧气浓度，并将氧通量计算为接下来 40 秒内氧气测量的负斜率。

然后通过让介质与室内空气平衡来校准氧传感器。根据高分辨率呼吸计测量的气压和标准大气氧浓度计算参考氧分压。使用绿色荧光传感器量化来自呼吸室的荧光信号。

以 400 至 500 毫伏的电压为传感器通电，产生的信号以 1 至 1， 000 的增益放大。接下来，在添加线粒体之前将TMRM添加到呼吸室中，并使用荧光信号的简单两点校准与添加线粒体之前的荧光团量来校准荧光信号。在完成呼吸测定滴定方案后，通过多次滴定解偶联剂来执行 TMRM 信号的最终校准，直到没有观察到 TMRM 荧光信号进一步增加，表明线粒体膜电位完全崩溃。

使用蓝色荧光传感器量化来自呼吸室的荧光信号，并为各个仪器的这些传感器通电，以捕获传感器线性范围内的预期信号。向呼吸腔中加入八微升两毫摩尔EDTA，以螯合阳离子，这些阳离子将与镁离子竞争与镁绿结合。然后，向呼吸室中加入四微升一毫摩尔镁绿。

用 10 x 2 μL 的 100 毫摩尔氯化镁顺序滴定校准原始荧光信号，在滴定间隔间隔一分钟以稳定荧光信号。确定ATTP合成速率，这是整个协议中ATP浓度随时间推移的斜率。使用绿色荧光传感器量化来自呼吸室的荧光信号。

以 300 至 400 毫伏的电压为传感器通电。产生的信号以1到1， 000的增益被放大。优化单个仪器的特定设置，以捕获传感器线性范围内的预期信号。

在添加线粒体之前，请对Amplex UltraRed测定进行化学设置和初始校准。加入 30 微摩尔 DTPA 以螯合可能干扰反应的阳离子。然后在呼吸测定室中加入超氧化物歧化酶或锯齿过氧化物酶和Amplex UltraRed。

让荧光信号稳定。然后加入0.2微摩尔过氧化氢两次，间隔五分钟。在整个测定过程中执行额外的两点校准，以允许调整测定的反应性，因为呼吸测量的化学性质在整个测定过程中发生变化，这些校准点的具体时间由研究者自行决定。

涡旋样品以保持均匀的样品悬浮液，并向每两毫升孵育室中加入15微升分离的线粒体悬浮液，以使结果代表18.75毫克肌肉的线粒体产量。在添加任何底物之前，测量残余耗氧量，并在完成后从底物非偶联抑制剂滴定或SUIT方案中每个步骤的耗氧量值中减去该值。使用通用 SUIT，以便对马骨骼肌线粒体功能进行初步表征。

首先将丙酮酸、谷氨酸和苹果酸依次滴定到每个腔室中，以产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，并通过复杂的一基泄漏氧化的NADH刺激非磷酸化呼吸。然后加入ADP，通过复合物磷酸化呼吸刺激磷酸化呼吸。加入琥珀酸盐通过结合复合物一和复合物二磷酸化呼吸产生磷酸化呼吸 加入鱼藤酮以阻断复合物。

由此产生的氧通量代表复合物二通过单独氧化琥珀酸盐来支持线粒体耗氧的能力。显示了马骨骼肌线粒体呼吸和相对膜电位的高分辨率呼吸测定图。由于该荧光团的抑制作用，与TMRM一起孵育的线粒体的呼吸值较低。

显示了含有高百分比富含线粒体的 1 型骨骼肌纤维并在接近静息代谢的条件下孵育的马骨骼肌的线粒体呼吸和 ATTP 合成。显示了马骨骼肌线粒体呼吸和过氧化氢产生的呼吸测定痕迹。高分辨率呼吸测量需要很大的耐心。

运行检测的人将有许多时间点，他们需要就是否已达到稳定状态以及下一步可能发生做出判断。我们只演示了一种滴定方案。还有几十种协议可以以同样的方式应用于解决有关线粒体代谢的特定问题。