小鼠和人泪腺类器官的建立、维持、分化、遗传操作和移植

使用泪腺类器官，人们可以研究某些基因如何控制泪腺稳态。此外，类器官可用于再生医学。成体干细胞衍生的泪腺类器官技术的主要优点是它允许健康和未转化的泪腺上皮细胞的生长和研究。

这些类器官最终可用于治疗干眼症患者。首先准备实验所需的培养基和材料，然后在实验前结合消化培养基的所有成分。在这种培养基中预先润湿手术刀，以避免组织碎片粘在上面。

从培养基中取出小鼠泪腺组织，将其放入培养皿中，并使用预先润湿的手术刀将其切碎。一旦组织块小于0.5立方毫米，用手术刀将它们从培养皿上刮下来，然后将它们转移到含有消化培养基的15毫升管中。对于非常小的人活检，将其直接放入消化培养基中，不要切碎。

将具有组织碎片的 15 毫升管在 37 摄氏度的水浴中孵育长达 15 分钟。同时，在火焰中缩小巴斯德移液器吸头，并在基础培养基中预润湿。为了便于解离过程，使用预先润湿的窄巴斯德移液管每五分钟上下移液一次切碎的混合物。

当在显微镜下可见许多单细胞和小团块时，通过加入10毫升碱基来停止解离。以400g旋转5分钟后，除去上清液，将沉淀重悬于10毫升碱基中，重复洗涤并沉淀细胞。通过 70 微米过滤器过滤切碎的混合物来去除大的、未消化的组织碎片和剩余的胶原纤维。

以 400g 离心洗脱液五分钟。除去上清液后，将细胞沉淀重悬于100微升冷细胞外基质或ECM中，用于单个小鼠泪腺和50微升冷ECM用于人活检，而不会产生气泡。使用 P100 在 12 孔悬浮板的每孔中接种多达 200 微升细胞，以在孔中产生约 20 微升液滴。

将板倒置在 37 摄氏度的加湿培养箱中 20 至 30 分钟，以使 ECM 固化。一旦ECM固化，每孔12孔板加入约1毫升室温小鼠扩增培养基。新鲜制备一毫升人分化培养基，其中含有诱导泪腺类器官分泌的单个成分。

在自动明场延时显微镜下，设置要在板中成像的位置，时间间隔为五分钟，持续时间为四小时。确保每个位置都可以看到整个 ECM 液滴。在开始成像之前，从要成像的孔中取出培养基，而无需将板从显微镜上移开，并用新鲜制备的，重悬良好的人分化培养基代替含有化合物，包括佛司可林和去甲肾上腺素。

作为阴性对照，包括具有更新分化培养基的孔。单击显微镜上的运行按钮，并在四小时后分析结果。如文中提到解离类器官后，弃去上清液。

将细胞重悬于80微升电穿孔缓冲液中。在1.5毫升管中，制备实验所需的质粒。将质粒添加到细胞中，并通过上下移液充分混合。

使用穿孔脉冲和传输脉冲的参数设置电穿孔器。将带有质粒的细胞放入电穿孔比色皿中。立即测量电阻，电阻应在 0.3 安培到 0.55 安培之间，并立即电穿孔。

完成后，将细胞转移到1.5毫升管中，并加入400微升电穿孔缓冲液，并补充有Rho激酶抑制剂。让细胞在室温下恢复30分钟。接下来，将细胞沉淀在 500 克中五分钟。

弃去上清液后，将细胞接种在200微升ECM中。凝固后，加入鼠标膨胀介质。对于类器官制备，在移植日前约三天拆分人泪腺类器官。

要从ECM中提取类器官，将分散酶添加到培养基中以达到每毫升0.125单位的最终浓度，并使用P1000彻底重悬ECM液滴以破坏它们。将板放回 37 摄氏度的培养箱中 30 分钟。将类器官重悬于10毫升碱基中以洗掉酶。

将细胞沉淀在400g下五分钟后，将它们重悬于补充有5%ECM的50微升冷人扩增培养基中。将类器官悬浮液放在冰上，然后立即进行移植。对于小鼠的原位移植，在胰岛素针中吸出类器官悬浮液。

当鼠标睡着时，快速将其侧放，主泪腺可触及。将五微升类器官悬浮液直接通过皮肤注入泪腺。让小鼠恢复，并每天评估是否存在任何与移植相关的不适，尤其是在眼睛中。

在解剖小鼠泪腺后，酶和机械消化产生小的组织碎片，包括腺泡和导管。在成功的小鼠泪腺类器官衍生中，7天后发现了直径约500微米的囊性类器官。人泪腺类器官在三到四天内生长为囊肿，并在组织分离后10到14天内达到完全生长的大小。

分别在分化培养基中五天和七天后，小鼠和人泪腺类器官变得更加致密。应用环AMP激活剂佛司可林或神经递质去甲肾上腺素导致类器官肿胀不到三小时.在成功的电穿孔中，生长出对潮霉素有抗性的类器官。

生长中的大于300微米的类器官克隆在分化之前被挑选出来。通过引导RNA靶向的Pax6位点的PCR扩增为所有选定的克隆产生了367个碱基对条带。使用靶向Pax6的引导RNA获得六个测序的纯合敲除小鼠泪腺克隆中的一个。

一些克隆生长良好，但一些类器官克隆在采摘后丢失或开始分化。在挑选的10个类器官克隆中，有7个生长良好。在将类器官注射到小鼠泪腺一个月后，通过染色人类特异性标记物（人核仁抗原）确认了类器官植入。

需要注意的一件事是不要过度消化组织，也不要过度消化类器官。否则，细胞可能会死亡，这将降低类器官的建立率。泪腺类器官可以通过组织学进行分析。

通过这样做，人们可以深入了解它们的细胞组成。