噬菌体是细菌噬菌体，已整合到细菌基因组中。我们正在使用转录组学方法来全面探索噬菌体对其细菌宿主生物学的影响。这里描述的方法解决了自发诱导噬菌体裂解循环的关键挑战。
仔细优化培养条件，可以在噬菌体状态下对基因表达进行清晰的分析。噬菌体存在于大多数细菌病原体中，但其意义通常不为人所知。这些工具可以阐明噬菌体作为多种细菌功能调节剂的作用。
有几乎无限的噬菌体宿主关系尚未得到研究。这代表了这些方案可以帮助预测的潜在治疗靶点的巨大未开发资源。主要挑战是找到合适的培养条件来平衡溶菌原生长和自发噬菌体诱导。
众所周知的次要挑战是莱森，即维持下游研究的RNA完整性。首先，通过将过夜培养物以 1 比 100 的比例接种在 100 毫升 LB 中来建立新鲜的溶菌原和指示宿主培养物。在 37 摄氏度下孵育，以 180 RPM 振荡。
为了监测溶菌原的生长，从接种点开始每小时收集一毫升样品，持续八小时。连续，通过将 100 微升加入 900 微升 LV 培养基中来稀释培养物。以最大速度涡旋，并继续稀释系列，从10到负1到10到负9。
将 10 微升所需稀释液点在 LB 螺旋板上。晾干并在 30 摄氏度下孵育 18 至 24 小时。孵育后，计算菌落数并使用给定公式计算活细菌细胞的数量。
接下来，为了枚举时间样品中的感染性噬菌体颗粒，将100微升对数期利福平抗性指示剂宿主细胞与利福平一起加入熔融顶部螺旋钻中。将 10 微升连续稀释的溶菌原培养物点到接种的顶部螺旋层上。晾干，在 37 摄氏度下孵育 18 至 24 小时。
孵育后，计算斑块的数量并使用给定的公式计算感染性噬菌体颗粒。将第一个烧瓶标记为非诱导烧瓶，将其他烧瓶标记为诱导烧瓶，并注明应收获每个样品的时间点。然后在8个250毫升烧瓶中以1:100的比例在80毫升LB中传代培养过夜生长的溶原培养物。
将烧瓶在 37 摄氏度下孵育，并以 180 RPM 振荡。90 分钟后，当 600 纳米处的光密度在 0.1 和 0.2 之间时，向未诱导的烧瓶中加入 4 微升 1% 冰醋酸。将 80 毫升培养物从未诱导的烧瓶中加入到 720 毫升 LB 中，并立即加入 160 毫升终止液，然后将烧瓶置于冰上 30 分钟以稳定 RNA 转录本。
接下来，将终浓度为每毫升1微克的诺氟沙星加入到含有80毫升培养物的诱导标记烧瓶中。充分混合，在 37 摄氏度下以 180 RPM 振荡孵育一小时。通过将 80 毫升诱导培养物加入 720 毫升 LB 中，使细胞恢复。通过添加终止溶液，每 10 分钟从每个烧瓶中收获细菌细胞，从 0 到 1 小时。
在4摄氏度下以10,000G离心15分钟，弃去上清液。在使用可调节的自动移液器轻轻地将沉淀重新悬浮在残留液体中之前。将悬浮液转移到 1.5 毫升微量离心管中，并在 4 摄氏度下以 13， 000 G 离心一分钟。
弃去残留的上清液并密封微量离心管，然后将沉淀快速冷冻到液氮中。向每个冷冻沉淀中加入一毫升Trizol，并通过移液使悬浮液均质化。在确定一组可作为目标噬菌体复制每个阶段标记的靶基因后，使用相关引物从基因组DNA中扩增每个靶基因。
使用文本手稿中描述的扩增条件进行PCR。PCR后，使用PCR纯化试剂盒纯化每个扩增子，并按照制造商的说明将其克隆到TA克隆载体中。通过Sanger测序验证每个克隆产物的序列。
在计算四个单独质粒的拷贝数后，通过在无核酸酶的水中连续稀释质粒DNA来制备每个标记基因的标准模板。在 96 孔板中为每个靶标添加 1 微升 CDNA 和相应的质粒标准品。并根据制造商的说明进行定量PCR。
PCR后，使用Excel程序绘制对数DNA拷贝数与循环阈值的关系图。执行线性回归计算以显示决定系数和线性方程。接下来，使用从线性回归导出的线性方程估计每个靶标的拷贝数。
然后使用来自标准曲线的线性回归和给定方程的参数计算PCR扩增的功效。在验证引物的效率百分比后，计算DNA的绝对拷贝数。自发性噬菌体产生的时间计数表明，在两小时时每个细胞的PFU数量最低，在六小时时每个细胞的PFU数量最高。
溶菌原在两小时时最稳定。因此，该条件用于QRTPCR分析。观察到 cro 基因的表达显着增加，CRO 基因是裂解复制的早期标志物，从未诱导培养物中的 2.31 倍 10 至第 9 拷贝，在诱导后 30 分钟观察到 3.02 倍 10 至第 11 拷贝。
同样，裂解复制的中期标志物P和O蛋白也表现出显著上调，从1.74倍10到第8拷贝到1.25倍10到第10拷贝，从6.05倍10到第2拷贝到5.68倍10到第5拷贝。裂解复制周期的晚期标志物在诱导后 30 分钟内在未诱导培养物中的表达显著增加。在测试的内部对照中，与16个SRNA或ProC基因相比，RPOD的表达最稳定。
与裂解复制标记相比，C-one基因的表达相对稳定。尽管如此，与裂解复制的标记物相比，C-one基因的拷贝数在非诱导培养物中仍然很高。没有好的数据或解释可以来自准备不良的RNA文库。
控制自发诱导和RNA完整性是最重要的事情。任何基因的时间动态都可以使用表达谱来研究。定制正确的实验条件和时间点对于正确映射任何刺激的生物反应非常重要。
该技术已经确定了两个不同的噬菌体宿主伙伴关系之间以前未知的相互作用。由于大多数细菌都含有未经研究的噬菌体，这种方法可以帮助发现许多新的治疗靶点或应用。
