使用宽场活细胞成像进行批量和单类器官分析的多参数肿瘤类器官药物筛选

该协议不仅允许研究人员简化他们的分析管道，而且还将允许他们从类器官流中提取更多信息，从而增强翻译相关性。该协议的主要优点是它将简化的工作流程与自动化和临床相关的分析管道相结合，从而使研究人员能够从一个单一的类器官筛选中获得令人信服的信息量。该技术可用于从这些离体类器官药物筛选中预测癌症患者的临床治疗反应，具有非常有希望的早期结果。

目的是使软件解决方案平台不可知，以便研究人员可以使用他们可用的活细胞成像仪器。首先酶解离六孔微孔板中细胞外基质或ECM圆顶中的患者来源的肿瘤类器官或PDTO。为此，首先吸出培养基，并用PBS清洗ECM圆顶一次。

然后，在孔中加入两毫升解离酶。使用一毫升移液器上下移取内容物 10 次，以机械方式解离圆顶中的类器官，然后在 37 摄氏度下孵育板 10 分钟。孵育后，上下移液内容物，并使用显微镜检查类器官是否正确解离为单个细胞。

将细胞悬液收集在 15 毫升管中，并通过加入 ADF+在室温下以 450 g 离心管五分钟使体积达到 10 毫升，并使用巴斯德移液器和抽吸泵吸出上清液。在使用所选方法计数细胞数量之前，根据沉淀的大小将沉淀重悬于100至200微升全胰腺导管腺癌或PDAC类器官培养基中。要将单个细胞接种在ECM圆顶中，通过加入所需量的解冻ECM来稀释适量的细胞悬液。

然后，在预热至37摄氏度的六孔板中每孔移取多达10个20微升液滴。倒置板并在 30 摄氏度下孵育 37 分钟。接下来，用补充有 10 微摩尔 Y-27632 的完整培养基覆盖孔，并在培养箱中孵育两到三天。

要收获两到三天大的类器官，首先吸出培养基，然后用PBS清洗类器官一次。然后，根据ECM圆顶的数量，将一到两毫升预冷至4摄氏度的类器官收集溶液添加到六孔板的孔中。将放在冰上的板在摇晃的平台上孵育10分钟。

现在，通过用一毫升移液器上下移液孔中的内容物来解离ECM圆顶。再次将类器官在冰上孵育10分钟，然后在显微镜下目视确认ECM圆顶的解离。将类器官收集在 15 毫升管中，在 PBS 中预涂有 0.1% BSA，并通过添加 ADF+在 4 摄氏度下以 200 g 离心管五分钟来弥补体积至 10 毫升。

接下来，吸出上清液，并根据其大小将沉淀重悬于最多一毫升的全PDAC类器官培养基中至所需的最终类器官浓度。打开移液机器人控制应用程序，选择方案，然后单击导入，然后将提供的补充文件6拖放到指定字段中。选择导入的协议。

根据"录机设置"字段中显示的布局，将所有实验室器具（包括冷却元件和塑料器皿）放入录机中。使用左侧插槽放置 25 毫升储液罐和冷却元件。接下来，单击运行协议并继续设置。

打开"实验室器皿设置"选项卡，单击"运行实验室器皿位置检查"，然后按照说明将移液机器人校准到新硬件。用冷却的类器官接种溶液填充放置在冷却元件顶部的 25 毫升储液槽，然后单击开始运行以使移液机器人开始运行。接下来，在4摄氏度下以100g的速度离心微孔板一分钟。

要使用数字药物分配器控制软件创建药物分配协议，请将鼠标悬停在板布局上方的板 1 上。选择编辑板属性，通过单击流体旁边的添加按钮，将板类型填写为 384 孔，将附加体积填写为 50 微升，DMSO 限制为 1%添加流体，然后双击新创建的流体进行命名。然后，选择基于DMSO或水性加吐温20的类别，并填写浓度。

要创建药物滴定的板布局，请选择孔，然后单击滴定。对于液体，选择感兴趣的药物，以及所需的最高浓度和最低浓度。对于重复，至少选择两个，并选择所需的滴定模式。

要为阳性对照创建板布局，请选择三个孔，单击设置值，然后从DMSO中的10毫摩尔原液中填充两微摩尔星形孢菌素以诱导最大细胞死亡。对于Cytotox Green，选择所有使用的孔，单击设置值，然后输入每孔60纳摩尔的值。对于阴性对照和DMSO归一化，选择所有孔，另外四个孔用于载体对照。

现在右键单击并选择归一化，然后再将归一化流体类指定为 DMSO。然后，归一化到最高等级体积，以获得每个孔中相等的DMSO浓度。接下来，单击左上角"运行"下的箭头，然后选择"始终模拟"，然后单击"模拟"以识别任何错误并获取要制备的每种药物的体积。

现在取消选中 运行 按钮下的始终模拟，然后单击运行以启动药物分配方案，然后按照说明进行操作。将密封膜涂在微孔板上以防止蒸发。打开活细胞成像仪控制软件，选择方法编辑器新建，然后转到文件导入示例方法XML文件。

或者，按照手稿中的说明创建一个新文件。然后，单击"开始"以启动扫描 T0.To 合并和压缩数据，创建一个新的父文件夹，用于传输活细胞成像仪控制软件在每个时间点为每次扫描生成的所有单个实验文件夹，并按照手稿中的说明命名相应的文件夹。在数字药物分配器控制软件中准备XLSX板图，方法是右键单击药物分配方案中的板图布局并复制所有孔以将数据粘贴到XLSX文件中。

去除Cytotox Green和星形孢菌素数据，添加细胞系基质，然后输入阴性对照和阳性对照。打开数据压缩工具。单击搜索，选择父文件夹，然后单击压缩以启动图像数据压缩。

所有TIFF图像文件都被压缩到一个HDF5中，用于父文件夹内的新数据集文件夹中的每个孔。要分析图像，请转到图像分析 Web 应用程序平台，登录，然后单击主页选项卡中的添加新项目。输入项目名称，按"继续"，然后选择"添加新实验"，然后再上传包含 HDF5 文件的数据集文件夹。

上传后，转到项目和实验文件夹，单击上传板图以获取其他功能。然后，依次单击"运行分析"，选择"多类器官分析"、"默认参数"，最后单击"分析"以启动图像分析。单击下载结果以下载原始数据表，其中包含每个孔的测量值以及分割的图像或视频，然后确认分析的准确性以进行进一步的数据处理。

为了解释类器官接种密度和大小的变化，使用基于生长速率的指标来减少重复之间的变化，如减少的误差线所示。阴性对照、阳性对照以及吉西他滨和紫杉醇联合治疗PDTO的图像显示，该疗法主要诱导生长停滞，细胞死亡量有限，对应于正常化药物反应或NDR，值略低于零。在使用另外两条线（PDAC_052和PDAC_087）后，观察到三条线之间的增长率存在明显差异，支持使用遗传资源指标。

与GR曲线相比，NDR剂量反应曲线导致三种不同患者之间的动态范围和分离增加。随时间推移测定NDR表明，PDAC_052和PDAC_060对低剂量吉西他滨-紫杉醇具有非常相似的细胞抑制药物反应，而对于相应的中剂量和高剂量，可以观察到明显的细胞抑制与细胞毒性反应差异。这些药物反应与在患者中观察到的临床反应一致。

克隆动力学显示，PDAC_087在治疗后具有最耐药的亚克隆，这与在患者中观察到的疾病的侵袭性一致，有趣的是，患者对阳性对照星形孢菌素也最不敏感。该方案最重要的方面是在播种期间保持所有含有ECM的溶液冷却，因为ECM的错误固化会干扰下游图像分析。湿实验室工作、图像分析和下游数据处理的自动化有助于加速研究并更轻松地确定新的联合疗法。