该方案以非破坏性方式提供有关肿瘤模型进展的信息。它还通过单一集合体中的整个药物治疗方案而不是依赖于年龄匹配样本来提供治疗反应的指示。在聚集体中获取细胞密度和活力的传统方法需要样品固定和切片，而我们的方法则以非破坏性方式提供数据。
因此，随着时间的推移，可以在单个聚合中跟踪更改。该技术有望提高我们对聚合模型的离散区域内药物反应的理解，并对这些模型在体内反应和药物筛选应用中的反映程度产生影响。首先，在标准条件下制备所需细胞系的70%至90%汇合细胞培养物。
按照标准胰蛋白酶消化方法从培养瓶中分离细胞单层，并将细胞悬浮液加入离心管中。将10微升细胞悬浮液加入血细胞计数器并通过显微镜计数以确定悬浮液中的细胞数量。通过离心沉淀细胞，并将细胞重悬于培养基中，所需浓度为每毫升2.5倍10至第五细胞。
对于用基底膜基质制备的悬浮液，从零下20摄氏度的储存中取出基质小瓶，并放入冰箱中解冻过夜。准备一个装有生长培养基的容器，冷藏10分钟以冷却。使用冷冻移液器吸头将基质加入到冷冻培养基中，使得该溶液的最终浓度为5%，将50微升该培养基加入到圆底，非粘附的96孔板的每个孔中，使得在加入细胞悬浮液后，这些孔中基质的最终浓度将为2.5%。
对于没有基质制备的悬浮液，向每个孔中加入50微升的普通生长培养基。将50微升细胞悬浮液分配到每个孔中。接种后立即在室温下将板以123G离心10分钟，以确保在每个孔的底部收集细胞沉淀。
利用 OCT 系统进行结构成像。将 A 扫描速率设置为 5.5 千赫兹，以进行高分辨率图像采集。将液体介质中样品的折射率设置为 1.33。
在屏幕右侧的图像参数窗口中，通过输入 X、Y 和 Z 值来设置视场，以便样本包含在此感兴趣区域中。单击3D采集模式，然后单击记录以收集样品的3D体积扫描。要创建卷重建，请打开 Imaris 并导航到其竞技场内转换后的 TIF 文件。
转到编辑，然后单击"图像属性"并将 OCT 图像中的体素大小输入到相应的 XYZ 框中。接下来，单击"确定"。单击对象树上方的"添加新曲面"。在树下方的菜单中，单击跳过自动创建并手动编辑。
在显示调整窗口中，手动滑动红色和黑色箭头以增强样品与背景之间的对比度，并改善样品的可视化效果。将切片位置调整到样品一条边缘处的切片。使用转义键将鼠标从导航模式更改为选择模式，然后单击"绘制"。
手动跟踪显示信号的区域的轮廓。通过在输入框中输入下一个位置来推进切片位置。下一个位置应小于或等于样品中比前一个位置进一步的100个切片。
手动跟踪显示信号的区域。通过样品的厚度重复此步骤，直到到达样品的另一边缘。然后单击"创建曲面"和左侧菜单将这些切片拼接在一起。
最后，单击"编辑"，然后单击"掩码选择"，然后单击"确定"以完成卷重建。要获取样品的总细胞密度，请选择添加新斑点。在算法设置菜单中，取消选择所有框。
单击蓝色箭头以移动到源通道屏幕。从显示的下拉菜单中，选择蒙版通道。在 XY 直径框中输入样品的平均细胞直径。
确保选中背景减法。单击蓝色箭头可移动到分类点的屏幕。在菜单底部的图形中，单击黄色阈值的左边缘并将其拖动到图形的左边缘，以便所有对象都包含在黄色阴影阈值中。
然后单击绿色箭头以完成点创建。通过单击"统计信息"获取标识的对象数。然后单击"总体"，最后单击"总点数"。
单击创建的曲面，然后导航到曲面样式质量选项卡。将选区更改为中心点，并将像素宽度更改为小于 20 以获得最佳可见性。导航到"统计信息"。
然后单击"详细"，然后单击"位置"并记录中心点的位置。从对象树上方的菜单中选择添加新参考框架。选中菜单中 X、Y 旁边的可见框和固定框。
单击并拖动参考框图标的中心，使其与中心点对齐。取消选择"XY 可见"和"修复"框，然后为 XZ 选择它们。再次单击并拖动参考框图标的中心，使其与中心点对齐。最后，对 YZ 平面重复此操作，在这三个固定平面之间交替，直到参考系与中心点完全对齐。
双击对象树中的参考框架，然后将其重命名为中心或类似名称。单击创建的点并导航到统计信息。然后单击详细，然后单击位置参考框架。
单击位置 X 参考框，直到它从最高值到最低值排序。记录最大值以获取聚合的半径。执行手动计算以确定其他感兴趣的位置。
为此，请在 X 中心值上添加 100 微米，然后使用中心点的 Y 和 Z 值定义沿中心轴的第一个位置。选择添加新点。然后选择"手动跳过自动创建编辑"。
按住键盘上的 Shift 按钮，然后单击屏幕上的任意位置以放置新位置。输入第一个感兴趣位置的 XYZ 位置值。然后选择"添加新参考帧"并将其与点对齐。
将 100 微米添加到每个连续的 X 位置。将最后一个参考系放置在距离样品外半径小于50微米的位置。单击创建的点并导航到统计信息。
在菜单的右下角，单击"将所有统计信息导出到文件"，然后将数据保存到电子表格中。打开电子表格。导航到距原点参考框选项卡的距离。
使用 mod 函数以数字方式将每个距离分配给其相应的参考系。过滤此列中的值以处理每个参考系中的距离。对于每个参考帧，使用 COUNTIF 函数计算距帧 50 微米范围内的物体数量。
生成的值对应于该区域插头中的像元数。将此值除以100微米插头的体积，得到细胞密度。学生的T测试显示，对于MDA-MB-231球体模型，球体核心的细胞密度明显高于过渡层和外层。
结果表明，该球状核在四天后被压实。在AU565和MDA-MB-231聚合模型中，基质的添加似乎不会影响体积或细胞计数，因此似乎对细胞增殖的影响可以忽略不计。相反，基质添加似乎重新分配了细胞密度，促进了显着的核心压实并降低了外层的细胞密度。
这些发现为基质使细胞聚集在不同乳腺癌细胞系中的物理机制提供了有价值的见解。接下来观察用基质制备的AU565肿瘤球体，用曲妥珠单抗处理成熟的聚集体，并通过五天的药物治疗方案评估区域细胞密度。在整个骨料厚度中每100微米设置一次插头。
随着时间的推移，在每个聚集体的内部500微米内观察到细胞密度的微小波动，表明细胞死亡最小。细胞死亡的可视化作为指示性药物反应，主要在肿瘤球体的外层，这与曲妥珠单抗的药物渗透问题一致。现在，我们可以在不牺牲结构的情况下，无损地测量聚集体中的细胞活力。
这样可以评估奇异肿瘤聚集体中的纵向药物反应，以识别候选抗癌药物的时间和渗透质量。
