剥离印迹技术:一种冷冻电镜样品制备方法，用于从多层或浓缩生物样品中分离单层

剥离-印迹技术允许将多层和浓缩的生物冷冻电镜样品分离成单层，以减小厚度、提高浓度并促进图像处理。在网格制备之前可以增加样品浓度，并且可以调整剥离印迹，使单层样品的密集分布，从而实现高效的数据收集。首先，堆叠两张孔径为20-25微米的滤纸，并在旁边放置一层长石蜡膜，纸张朝上。

将一张亚微米滤纸放在另外两张滤纸的顶部。将反毛细管镊子放在弯曲的腿朝上，直腿朝下，并选择光滑或有光泽的一面朝上的 600 目网格。将镊子放在培养皿或其他凸起的表面上，以避免干净的网格与其他物品接触。

从石蜡膜上取下纸张，拉动侧面以形成一个小边缘。移取两滴150微升的4%海藻糖溶液，距离石蜡膜的一个短边约1至2厘米。两滴应相距约一厘米。

接下来，在单独的工作台上或地板上，将液氮倒入一个小的聚苯乙烯泡沫容器中，并将一个小的冷冻电镜网格容器放入液氮中。用不起毛的湿巾覆盖聚苯乙烯泡沫容器。要从云母中漂浮碳膜，请使用 Dumont 5 镊子，在其中一滴海藻糖溶液上以轻微的向下角度触摸云母的一侧。

向下移动云母，让水张力慢慢地从碳膜上抬起。一旦碳膜漂浮在液滴表面，就释放云母。目视检查碳膜，以避免使用以裂缝形式损坏的碳。

将反毛细管镊子以20-30度角固定的网格插入相邻位置的海藻糖滴中，然后将网格居中到碳膜下方。拿起碳膜，将网格保持在相同的方向，然后缓慢地将网格降低到第二滴海藻糖的表面上，而不会破坏滴的表面张力。这将去除不必要的碳膜，这些碳膜可能已经缠绕在网格边缘到粗糙的一面。

旋转反毛细管镊子并将它们放在培养皿上，网格的碳面朝下。将1.3微升样品移液到网格顶部的轻微海藻糖弯月面中。然后，移液约8-10次，以混合海藻糖和样品在网格的两侧。

将一滴或多滴 1.7 微升海藻糖溶液移液到石蜡膜上，同时将样品海藻糖溶液在网格上孵育一分钟。将网格旋转回其原始位置，碳膜朝上，并使用反毛细管镊子将网格压在亚微米滤纸上。一旦溶液被滤纸吸收并且碳膜平放，等待三秒钟，然后抬起网格并将其垂直移动到 1.7 微升海藻糖溶液上。

这些步骤可以在一到三次或更多次重复之间重复，具体取决于样本。将网格吸干在两张滤纸上，然后从滤纸上提起网格。大约 13 秒后，根据湿度和样品缓冲液，将网格插入小聚苯乙烯泡沫塑料容器中的液氮中，并将其放入冷冻电镜网格容器中或直接转移以进行冷冻电镜筛选或数据收集。

此处显示了经受剥离印迹法的人白三烯 C4 合酶的 2D 晶体样品。箭头左侧的区域在碳膜和网格条之间的接触区域中在很大程度上减少为单层2D晶体，网格条被剥离印迹然后移动。箭头右侧的区域不受剥离印迹的影响。

图像的下半部分表示由于应用剥离印迹而产生的具有大的，主要是单层磷酸脂质双层的区域。上半部分不在网格棒和碳膜之间的接触区，因此包含具有两个磷脂双层的完整脂质体。400目网格的网格方块显示了网格条的足迹和产生的剥离印迹区域，以及未与网格条接触或剥离印迹迭代次数较少的区域。

这些图像显示了使用非常薄的碳膜在亚微米滤纸上反向注射制备的EM网格的印迹。图像是与膜初次接触时的单帧，接触后1， 000毫秒和接触后2， 000毫秒。箭头表示毛细管压力使碳膜破裂的网格正方形。

避免碳膜破裂并将亚微米滤纸与 1.7 微升海藻糖滴液滴相结合，然后分离层是关键步骤。剥离印迹样品用于高分辨率冷冻电镜数据收集，然后进行图像处理以进行结构测定。剥离印迹允许结构化测定单层蛋白质2D晶体，这些晶体以前对于冷冻电镜来说太厚了。

此外，它可以将各种样品浓缩成碳膜上的单层。