确定放射性标记抗体与固定抗原的结合亲和力（K_D）

该方法可以确定放射性标记抗体与其抗原的结合亲和力。它还将测量结合的特异性。这种简单方法的主要优点是仅对放射性标记抗体的结合亲和力进行特异性表征，而不受未结合亲本抗体的干扰。

该技术定量验证放射性标记抗体与其靶标结合的能力。这对于核成像和各种疾病的核治疗中的应用非常重要。演示该程序的将是Erika Belitzky，一位来自我实验室的研究生助理。

首先，通过在50毫升锥形管中加入191毫克碳酸氢钠和23.9毫克碳酸钠来制备固定缓冲液。然后，加入40毫升18兆欧水，通过涡旋溶解。现在，将pH值调节至9.0，然后将总体积降至50毫升。

接下来，通过将200毫升PBS和100微升吐温20加入250毫升瓶中来制备200毫升洗涤缓冲液。还通过加入50毫克BSA和25微升吐温20至50毫升PBS制备50毫升结合缓冲液，并通过涡旋混合。向50毫升PBS中加入1.5克BSA，制备封闭缓冲液，轻轻涡旋混合。

在固定缓冲液中稀释抗原。然后，取一个可破碎的96孔平底板，并在八乘三阵列中每个24孔的底部加入100微升抗原。用密封胶带盖住板，并在四摄氏度下孵育过夜。

第二天，用洗涤缓冲液将盘子洗三次。将板在水槽中快速倒置以处理液体，并将板在一堆纸巾上敲击以除去多余的液体。然后，在含有抗原的孔中，使用多通道移液器每孔加入300微升洗涤缓冲液。

每孔向 24 抗原包被孔和 96 孔板的 24 个空孔中加入 300 微升封闭缓冲液。然后，将板在环境温度下孵育一小时，并用300微升洗涤缓冲液洗涤板的每个孔三次。在结合缓冲液中对放射性标记的抗体进行三倍连续稀释，在板上指定为A至H的八行。

首先，计算制备第一浓度的1.2毫升溶液所需的放射性标记抗体的储备体积。然后，向标记为B至H的微量离心管中加入800微升结合缓冲液，并将所需体积的结合缓冲液加入到标记为A的微量离心管中。将计算的放射性标记抗体的原液体积加入管A并轻轻涡旋。然后，使用微型离心机向下旋转以收集管底部的所有液体。

接下来，从两个A向管B中加入400微升液体，涡旋后，使用微型离心机将其旋转下来。类似地，将溶液从管B加入管C，C到D，直到管H.每孔加入100微升每个稀释液到三个用抗原固定的孔和三个仅用BSA封闭的孔中。现在，向标记为A标准品至H标准的微量离心管中加入每种稀释液的100微升，并将这些离心管保存为放射性标记的抗体标准品，以便在γ计数器中测定。

将板在37摄氏度下孵育一小时，轻轻摇动。为每个孔标记微量离心管，如手稿中所述。使用真空抽吸器从96孔板的孔中抽吸放射性标记的抗体。

现在，使用多通道移液器，向每个孔中加入300微升洗涤缓冲液。吸出洗涤缓冲液，再重复洗涤四次。将孔分解成适当的微量离心管。

计数管中的放射性，抗原标记为H1，H2，H3，H3至A1，A2，A3，然后BSA仅标记为H4，H5，H6，使用伽马计数器至A4，A5，A6。放射性标记的阿米塔马对EGFR和cMET蛋白表现出特异性结合。与EGFR和cMET蛋白结合的单臂放射性标记晶圆厂也保留了类似的结合亲和力。

饱和度结合图显示，当放射性标记抗体的浓度过低时，如线性曲线所示，未达到饱和度。过高的放射性标记抗体浓度导致饱和，没有明显的对数生长，如水平平台所示。此外，由于高浓度的放射性标记抗体，出现了高非特异性结合。

该过程可能需要多次尝试来优化每种特定放射性标记抗体的浓度范围。使用来自阴性结果的数据来帮助设计未来的实验。一旦知道结合亲和力，它就可以用作其他体外测定的基准，作为放射性标记抗体表征的一部分。