使用冻热裂解和同量异位载体进行质谱分析的单细胞蛋白质组学制备

SCoPE2可以定量来自数千个没有抗体的单个哺乳动物细胞的数千种蛋白质。该协议可以帮助发现蛋白质组异质性，否则批量分析将不可见。使用SCoPE2方法的单细胞蛋白质组学旨在为研究人员提供从移液器到液体处理机器人等一系列资源。

SCoPE2通过深入了解来自同一群体的单个细胞之间的蛋白质丰度差异，广泛适用于许多研究领域，包括癌症和免疫学。首先，通过将带有分选单细胞的 384 孔板放入热循环仪中，在 90 摄氏度下加热 10 分钟，然后在 12 摄氏度下冷却，开始细胞裂解程序。在台式板旋转器中以 18 至 22 摄氏度的温度短暂旋转板。

在 18 至 22 摄氏度的水浴超声仪中超声处理板五分钟。然后，将其放在冰上。为了进行胰蛋白酶消化，准备100微升预混液，并使用液体处理器将0.2微升预混液添加到384孔板的每个孔中。

密封板，涡旋五秒钟，然后在台式板旋转器中以 18 至 22 摄氏度向下旋转。将 384 孔板在 37 摄氏度下加热 3 小时，盖子温度设置为 52 摄氏度。要设置串联质量标记反应，请从零下 80 摄氏度的冰箱中取出 85 毫摩尔的串联质量标记库存。

在打开它们之前，将试管加热至室温，并在无水乙腈中将标签稀释至 22 毫摩尔。使用这种标记策略，使用液体分配机器人或手动移液器向 384 孔板的每个孔中添加 0.5 微升稀释的串联质量标签。密封板，涡旋五秒钟，然后在台式板旋转器中以 18 至 22 摄氏度向下旋转。

让标记反应在 18 至 22 摄氏度下进行一小时。为了淬灭串联质量标记反应，使用液体处理器向384孔板的每个孔中加入0.2微升0.5%羟胺，用HPLC级水稀释。密封板，涡旋五秒钟，然后在台式板旋转器中向下旋转，然后将板保持在 18 至 22 摄氏度 30 分钟。

LC-MS分析制备是通过从零下80摄氏度的冰箱中取出组合载体或参考物质开始的。对于每组，将一微升载体和参考材料移液到第一孔中，将是单组的一部分。从第一个孔到下一个孔的整个体积移液。

继续将整个体积从一个孔移液到下一个孔，直到一组中包含的所有孔都合并到最后一个孔中。对于每组，加入五微升在HPLC级水中稀释的50%乙腈，以获得每组中包含的第一个单细胞孔。从第一个孔到下一个孔的整个体积移液。

继续将整个体积从一个细胞移液到下一个细胞，直到一组中包含的所有孔都合并到最终孔中。现在将每组转移到自动进样器玻璃插件中。将所有组组合并放入玻璃插入物后干燥样品。

在LC-MS-MS分析之前，向每组添加1.2微升0.1%甲酸，以重悬标记的肽。将自动进样器插入物放入玻璃自动进样器小瓶中，并用盖子关闭每个样品。涡旋每个小瓶五秒钟以确保重悬完成，然后在 18 至 22 摄氏度的小瓶旋转器中向下旋转。

确保每个样品都位于插件的底部，而不是溅在侧面。将样品瓶放入自动进样器托盘中，每组进样一微升样品进行LC-MS-MS分析。单个细胞的酶切和标记效率可能不像载体那样直接测定，但DO-MS软件提供了估计酶切和标记效率的图表。

消化不良表现为混裂肽与其完全裂解的对应物的强度高。集合中要考虑的另一个因素是每个串联质量标记通道中中报告离子强度中位数缺失数据的比例。当成功制备单细胞时，每个细胞和阳性对照的缺失数据远低于阴性对照样品。

在LC-MS-MS样品制备过程中，小心处理液体对于提高肽的回收率至关重要。可以使用同量异位载体制备每孔约100皮克至100纳克的小样品用于蛋白质组学分析。SCoPE2使世界各地的研究人员只需使用常用试剂和市售设备即可进行单细胞蛋白质组学测量。

它适用于手动处理或通过机器人液体处理实现高通量自动化。