这项新技术将离子淌度-质谱与分子建模和反应动力学理论相结合，以确定三元复合物的两个竞争解离反应的相对热化学。这些技术的组合表征了反应物和产物的反应途径、构象结构以及配体与金属离子形成三元络合物的亲和力。本研究模拟了用于重组蛋白纯化的两种潜在肽标签的反应性，其中标签与固定化金属亲和柱中由次氮基三乙酸螯合的金属反应。
首先将 2 毫升样品装入 2.5 毫升钝鼻注射器中，并使用仪器的注射泵以每分钟 10 微升的流速将样品注入仪器的电喷雾中。将仪器置于负离子淌度-质谱或 IM-MS 模式。通过打开质谱程序并选择光谱，确定带负电荷的替代金属结合三元复合物或amb-metal-NTA复合物的质荷同位素模式。
然后，选择工具，然后选择同位素模型。在弹出窗口中，列出配合物的分子式，选中显示带电离子框，负电荷输入1，然后单击 OK.In 显示的配合物同位素模式，注意最低质量峰。在仪器软件中，选择设置，然后选择四边形配置文件。
然后，选择手动固定并输入最低同位素模式峰的质量数。单击更新并关闭窗口。再次选择"设置"，然后单击"解析四元"。
从第一次转移碰撞能量开始收集负离子IM-MS光谱，使用5分钟的运行时间和2秒的扫描时间。重复以收集其他每个碰撞能量的IM-MS光谱。利用三元金属-NTA复合物和两种产品（NTA-金属复合物和amb-金属复合物）的综合到达时间分布或ATD区域，以标准化为相对百分比尺度。
从重复阈值碰撞诱导解离或TCID测量中，找到每个数据点的平均值和标准偏差。然后，将实验室框架传递碰撞能量转换为质心碰撞能量。要测量碰撞截面，请使用仪器操作条件收集 10 ppm 聚 DL-丙氨酸或 PA 样品的负离子 IM-MS 光谱 10 分钟。
然后，收集每个三元复合物的IM-MS谱图5分钟。提取每个PA和三元配合物的ATD，并使用"保留漂移时间"选项将其文件导出到质谱软件。从相应 ATD 曲线的最大值中查找平均到达时间。
使用横截面校准方法将平均到达时间转换为三元复合体的碰撞截面。从 CRUNCH 主菜单中，打开包含质心能量或产品与 ECM 相关的相对强度的 GB5 文本文件。回复"否"以读取参数。
然后，选择"建模"，然后选择"设置所有参数"。从反应模型选项中，选择默认的阈值 CID 选项，然后选择 RRKM，并在三元配合物的能量转移分布上进行积分。为建模的独立产品渠道输入 2，然后选择 计算横截面。
对于非卷积模型的类型，选择 0 开尔文横截面，其中包括由于从碰撞单元到飞行时间探测器的 50 微秒时间窗口而导致的动力学偏移的统计 RRKM 校正。对于卷积选项，请选择 Tiernan 的双积分，其中包括三元络离子和氩碰撞气体之间平移能量分布的卷积。对于数值积分方法，请选择具有预先保存的横截面的高斯正交。
从输入分子参数的选项中，输入 G 以读取包含三元复合物的 PM6 振动和旋转频率的结构建模文件。回答 是 对问题:其中一个反应物是原子的吗？写入建模文件的位置和名称。
输入 1 表示离子电荷，输入 1.664 表示氩气的极化率。离子的质量和目标的质量分别用于三元配合物和氩气，并自动从GB5文本文件中读取。输入 0 表示谐波振动。
按回车键从结构建模文件中读取一维和二维旋转常数。为受阻转子处理选择默认值 0，为分子对称性选择默认值 1。选择默认的 300 开尔文作为反应物温度。
选择"集成"作为降低状态密度数组的方法。选择"是"以截断能量分布。输入 40000 波数作为分配的最大能量，输入 2 波数作为箱大小，32 作为能量分配中的点数。
对于 TCID/RRKM 模型的参数，为更改选择是，为固定时间输入 0，为检测窗口的上限输入 0.000050 秒。对于产品通道 1，从解离通道选项中选择 1 表示单个转移状态，选择 0 表示无顺序解离。对于过渡状态类型，选择 1 表示动态观察。
选择 G 可读取建模程序文件，其中包含 amb-metal 配合物和 NTA 产品的 PM6 旋转和振动参数。输入否:相空间极限转换态之一（PSL TS）是原子的吗？输入 amb-metal 复合体文件的位置和名称。
使用 1.062 作为刻度频率，按 Enter 键表示原子数，然后输入 No 表示:分子是线性的吗？对包含 NTA 产品的振动和旋转频率的建模文件重复相同的操作。输入轨道 TS 的说明。输入1.0表示金属离子的电荷，然后输入NTA的极化率和偶极矩。
选择0开尔文作为旋转温度，选择锁定偶极子作为轨道过渡态的处理。输入金属离子和NTA的平均质量数。按回车键从建模文件中读取一维和二维旋转常数。
选择0表示受阻转子，1表示分子对称性，1表示反应简并。输入"无更改"选项。对于产品通道 2，选择 1 表示单过渡态，0 表示无表示顺序解离，1 表示轨道转移态类型。
选择 G 以读取包含 NTA 金属配合物和磁力轴承产品的 PM6 旋转和振动参数的建模文件。然后，输入轨道 TS 的描述。输入1.0表示NTA-金属络合离子的电荷，并输入amb的极化率和偶极矩。选择0开尔文作为旋转温度，选择锁定偶极子作为轨道过渡态的处理。
输入 NTA 金属配合物和磁力轴承产品的平均质量。按回车键从建模文件中读取一维和二维旋转常数。选择0表示受阻转子，1表示分子对称性，1表示反应简并。
然后，输入无更改。要处理非活动的二维旋转，请选择统计角动量分布的默认选项，并将 P-E、G 与 J 分布积分。在积分中的点数中使用默认值 32。
对于"模型"菜单，选择"优化参数以拟合数据"，然后分别输入最小能量和最大能量以开始和结束数据拟合。选择 1 作为加权模型的实验标准差。根据数据，选择通常为 0.01 到 0.001 的最小可接受标准差。
使用 E0 收敛极限的默认值并选择 No 将任何参数保持在当前值，0.5 和 2.0 电子伏特表示下限和上限，2 表示导数评估方法。从"优化"菜单中，选择"开始优化"。CRUNCH程序将根据实验数据优化选定的TCID模型。
最后，在"模型"菜单中，选择T处的δ-H和S，用于两个解离通道的热化学评估。代表性图像显示了替代金属结合A和H肽的主要结构。颜色突出了潜在的金属结合位点。
这里显示了形成amb-金属和NTA金属产物离子的能量依赖性。质心碰撞能量，其中amb-metal-NTA三元复合体有50%的解离，包含在图表中。代表性图像显示了能量分辨TCID方法的动力学模型。
ambH-锌-NTA配合物与氩气之间的碰撞导致解离为ambH-锌配合物和游离NTA，或NTA-锌配合物和游离ambH产物。阈值能量E1和E2分别相当于ambH-锌-NTA配合物与ambH-锌配合物和游离NTA或ambH-锌-NTA配合物与NTA-锌配合物和游离ambH反应的0开尔文解离焓。此处显示了 A 和 H 的 PM6 几何优化的三元 amb-metal-NTA 配合物。
这些构象用于实验数据的TCID建模，并通过比较它们的PM6电子能量以及它们计算的碰撞截面与IM-MS测量的碰撞截面相比如何从其他候选结构中选择。这些图像描绘了四个amb-metal-NTA配合物的能量解析TCID。对于物质 A 和 H，此处显示了具有复杂 CRUNCH 阈值拟合的 amb-金属和 NTA 金属的乘积离子。
能量值是amb-metal-NTA与amb-metal和游离NTA的反应，或amb-metaL-NTA与NTA金属和游离amb的反应在0开尔文处的解离焓。此处显示了吉布斯自由能缔合能（以千焦耳/摩尔为单位）和从解离焓（净零开尔文）得出的地层常数与使用 PM6 参数的静态力学计算的比较。NTA-镍和游离ambA的反应形成ambA-镍-NTA复合物表现出最高的形成常数，并且代表了ambA标记的蛋白质被亲和柱内的NTA-镍固定的反应。
嘎吱嘎吱拟合需要仔细筛选反应物和产物，以获得准确的阈值能量。需要分子建模方面的专业知识来获得结构和可靠的分子参数。这里描述的整体方法可以开发用于筛选设计用于结合金属辅因子和蛋白质活性位点以阻断酶促功能的分子的有效性。
