分离肺内动脉和平滑肌细胞以研究血管反应

本研究描述了分离大鼠肺内动脉和血管平滑肌细胞。采用了几种实验方案，例如使用器官浴技术来研究肺内动脉的血管反应。肺内动脉和血管平滑肌细胞是研究血管生理学和病理生理学的极好模型。

该技术的改编可以评估任何药物，提取物或植物化学物质的血管反应。将孤立的肺内动脉环安装在器官浴中，可以使用孤立的肺内动脉来评估药物在调节各种疾病（包括肺动脉高压）中的作用。实验方案在技术上是可行的，但关键步骤很复杂，对于成功至关重要，因此进行视觉演示使其更容易理解和遵循。

演示该程序的是Naresuan大学医学院生理学系心血管研究单元实验室的生理学硕士生Kittiwoot To-on。首先用11厘米的剪刀切开肺的单个叶，并将其放在9厘米的培养皿上，内侧或肺根朝上。从上到下观察并确定静脉、支气管和动脉的排列情况。

用剪刀纵向切开支气管。然后用11厘米长的镊子抓住支气管的尖端。轻轻解剖并将支气管和静脉从肺部取出。

用镊子抓住肺内动脉的尖端，用剪刀小心地将其从肺组织中解剖出来。将孤立的肺内动脉保持在冷克雷布斯溶液中，直到器官浴组件建立起来。隔离肺内动脉后，用11厘米的剪刀纵向切开肺内动脉的主分支，切成2毫米的条状。

将肺内动脉试纸浸入DM中，然后将试纸在含有每毫升木瓜蛋白酶1毫克，0.04%BSA和0.4毫摩尔DTT的DM中在4摄氏度下孵育一小时。然后在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。在DM中每毫升加入一毫克的IA型胶原酶，并再次在37摄氏度下孵育五分钟。

将组织转移到新鲜的DM中，并使用玻璃巴斯德移液管轻轻研磨分散。继续研磨，直到在显微镜下的沐浴液中可见孤立的血管平滑肌细胞。如前所述隔离肺内动脉，并将肺内动脉的主要分支切成约2毫米长的环。

通过将肺内动脉环穿在两根直径为 40 微米的不锈钢丝上，将它们固定在器官浴室中。将装有肺内动脉环的不锈钢线连接到连接到数据采集装置的等长力传感器和安装了用于数据记录和分析的合适生理软件的计算机系统。然后轻轻地将肺内动脉环的张力提高到一克。

让血管段在 1 克的静息张力下平衡约 45 分钟。在平衡期间，确保克雷布斯溶液每15分钟定期更换一次。平衡后，通过测量血管收缩到高细胞外钾溶液来测试血管的活力。

通过计算用PE预收缩的环中对乙酰胆碱的松弛反应来评估内皮的存在与否。通过用小线轻轻摩擦血管内部以诱导剥蚀来机械地去除内皮。然后在测试实验开始前平衡动脉环30分钟。通过用PE预先收缩肺内动脉环来研究植物提取物的松弛作用。然后小心地将每毫升0.1至1000微克的植物提取物累积添加到内皮完整环和内皮剥离环中，以诱导血管松弛并获得浓度依赖性反应曲线。

确保用作溶剂的有效DMSO也经过类似的评估，以用作阴性对照。评估文本手稿中提到的植物提取物的血管松弛作用机制。然后在收缩到PE稳定后，加入累积浓度的植物提取物。

将植物提取物的效果呈现为存在抑制剂时肺内动脉环的松弛百分比与无抑制剂的肺内动脉环的反应相比，并构建浓度反应曲线。在内皮完整肺内动脉中，植物提取物引起血管松弛的浓度依赖性反应。根除内皮细胞可显著降低植物提取物诱导的血管松弛，EC50增加2.2倍，eNOS和EDHF抑制明显降低植物提取物的血管松弛反应。

这会将浓度响应曲线向右移动，并在不改变E最大值的情况下增加EC50。相反，吲哚美辛对植物提取物的血管松弛剂反应没有影响。在内皮剥落的肺内动脉环中，钙激活的钾通道阻滞剂降低了对植物提取物的血管松弛反应。

而电压门控或ATP敏感钾通道的阻断剂没有显示偏差。与植物提取物一起预孵育抑制了氯化钙诱导的收缩。内皮剥去的肺内动脉环与无钙克雷布斯溶液和 PE 预孵育，呈现短暂收缩。

与车辆相比，植物提取物显着减少了PE引起的收缩。在手术过程中，必须尽早清楚地识别静脉、支气管和动脉。切割或损伤动脉会减少其长度并影响血管反应。该技术可用于研究可能作为肺血管疾病（如肺动脉高压）治疗原型的化合物。