细胞外葡萄糖消耗作为细胞和组织离体葡萄糖摄取的间接测量

葡萄糖摄取是了解健康和疾病的关键。由于葡萄糖在人体的代谢和结构需求中起着关键作用，并且在调节中起着至关重要的作用。葡萄糖的细胞外测量允许开发高通量测定，用于响应营养素或药物的不同遗传背景的细胞，组织和器官中葡萄糖摄取动力学。

该测定将是发现糖尿病，癌症，中枢神经系统退行性疾病，肥胖以及所有葡萄糖和代谢疾病的治疗方法和营养的宝贵工具。该测定需要调整饥饿和刺激的时间，应基于不同组织和细胞培养物的代谢特异性。培养3T3-L1小鼠成纤维细胞，将10个细胞接种到6个细胞中，在296孔板中的20毫升培养基1中稀释。

每孔板100微升细胞悬液，确保通过混合保持该悬液的均匀性。在 37 摄氏度的培养箱中培养细胞 48 小时，无需更换培养基，直到约 70% 至 80% 汇合。通过在同一培养基中培养细胞48小时来保持细胞汇合和禁食。

根据所需的空腹分解代谢状态，将孵育时间从 24 小时到 72 小时不等。从 96 孔板中的细胞中倒出培养基。使用无菌纸巾吸收剩余的液体。

用每孔100微升PBS冲洗96孔板，并用无菌纸巾吸收剩余的液体。每孔加入100微升无葡萄糖DMEM，孵育40分钟。根据细胞类型刺激和所需的禁食水平调整孵育时间。

对每个模拟条件使用八个仿行。因此，为每个模拟条件准备一毫升。使用七种不使用胰岛素的模拟条件。

FD葡萄糖为2.5微克/毫升，1微克/毫升，0.5微克/毫升，0.2微克/毫升，0.1微克/毫升，0.05微克/毫升和0毫克/毫升在196孔板中。使用胰岛素的七种刺激条件。FD葡萄糖为每毫升2.5微克，每毫升1微克，每毫升0.5微克，每毫升0.2微克，每毫升0.1微克，每毫升0.05微克和0微克/毫升在另外96孔板中。

为了制备刺激条件，稀释一微升每毫升5毫克的FD葡萄糖工作溶液和999微升无葡萄糖DMEM，以获得一毫升的工作储备溶液。使用该工作储备溶液，制备 1 至 2000、1 至 5， 000、1 至 10， 000、1 至 25， 000、1 至 50， 000 和 1 至 100， 000 个 FD 葡萄糖妄想，以获得 2.5 微克/毫升、1 微克/毫升、0.5 微克/毫升、0.2 微克/毫升、0.1 微克/毫升， 0.05微克每毫升在两毫升管中，紧接着在没有灯的生物安全柜中进行实验。在这些条件下，每种情况下都加入一微升胰岛素。

孵育40分钟后，从96孔板中的每个孔中倒出无葡萄糖DMEM，并用无菌纸巾吸收剩余的液体。从前面描述的各种处理条件中向一列的孔中加入100微升。并且从相同的处理条件到两个96壁板中沿行的孔的100微升。

标记使用这些条件的板，有和没有胰岛素。将无葡萄糖DMEM单独添加到对照孔中。将板在黑暗的细胞培养箱中孵育40分钟。

细胞被刺激40分钟后。将刺激培养基从两个板转移到新的96孔板中，保持相同的实验布局。用PBS清洗细胞。

取出PBS并将任何剩余的溶液倒入无菌纸巾上。将蛋白酶抑制剂添加到放射免疫沉淀测定缓冲液中以保护蛋白质。将含有放射免疫沉淀测定的板放入摇床中30分钟。

使用酶标仪，分别测量485纳米和535纳米激发和发射波长的荧光。首先在含有细胞外FD葡萄糖的培养基中，然后在平板上用放射免疫沉淀测定细胞在30分钟结束时孵育。根据制造商的说明进行BCA蛋白测定。

量化含有放射免疫沉淀测定细胞的每个孔中的蛋白质浓度。使用10微升的放射免疫沉淀测定匀浆，测量蛋白质浓度，一式三份以提高96孔板的测量精度。根据与每个 96 孔板上的样品一起分析的蛋白质标准品定量蛋白质。

将收获的组织或器官在含有PBS的六孔板中孵育一分钟。在单独的孔中处理每个组织或器官。一分钟后，将每张纸巾放在无菌纸巾上以吸收PBS。

将组织或器官转移到含有4， 000微升无葡萄糖DMEM的单独六壁板中，并孵育两分钟。两分钟后，取出组织并将其转移到含有0.29毫摩尔FD葡萄糖工作溶液的六孔板的孔中。将含有组织的六个孔板在37摄氏度的FD葡萄糖工作溶液中孵育。

孵育0、10、20、30、40、60、90和120分钟后，从每个孔中收集100微升FD葡萄糖工作溶液，并将收集的100微升FD葡萄糖工作溶液转移到96孔板中，分析细胞外FD葡萄糖耗竭的动力学。收集前后摇晃。使用酶标仪分别测量485和535纳米发射波长激发时的荧光。

在胰岛素存在的情况下，FD葡萄糖细胞内摄取的剂量依赖性显着增加。与没有胰岛素刺激的样品相比，胰岛素刺激导致细胞外FD葡萄糖水平显着降低。FD葡萄糖的细胞外耗竭可以测量葡萄糖摄取的变化，其准确性与细胞内FD葡萄糖摄取相当。

在孵育120分钟内，细胞外FD葡萄糖未在非刺激的对照内脏脂肪中耗尽。相反，在解剖前用胰岛素或AAC2对小鼠进行预处理，分别在30分钟和60分钟的时间间隔内导致细胞外FD葡萄糖的显着消耗。与非刺激肝外植体相比，胰岛素刺激的肝外植体中的细胞外FD葡萄糖未耗尽。

细胞外FD葡萄糖以时间依赖性方式显着降低，孵育60分钟后，在含有未处理脑的细胞外培养基中观察到用AAC2.22%葡萄糖消耗预处理的肝外植体。与胰岛素处理小鼠的大脑一起孵育的培养基显示FD葡萄糖线性降低5%。AAC2刺激的大脑导致在最初的20分钟内细胞外FD葡萄糖的显着迅速下降到67.4%。

涉及洗涤的物质对于去除培养基和/或器官中的微量葡萄糖、血液或血清尤为重要，因为它会干扰这些培养基的荧光读数。在高通量鉴定具有升糖特性的基因中的代谢物化合物以及它们在体内作用的最佳条件后，可以通过标记的FD葡萄糖和PET扫描进行验证，以确认葡萄糖在特定器官中的积累。这种发现血糖作用的技术既有利于删除许多代谢物，治疗剂或其组合，又突出了它们在不同器官中的作用。