辅酶Q过量设置下线粒体通透性转变孔隙的开放概率评估

该方案为研究线粒体通透性过渡孔的低电导率开口提供了一种新的方法。该技术的主要优点是它提供了一种简单的方法来测量孔隙的开放概率作为线粒体膜电位的函数。该技术可以很容易地应用于从任何器官系统和物种中分离出来的线粒体。

首先校准氧电极，将50%氯化钾电解质溶液滴在电极盘圆顶的顶部。在电解质滴上放置一小块两平方厘米的香烟纸垫片，上面覆盖着一块稍大的聚四氟乙烯膜。然后使用涂药器工具将小电极盘O形圈推过电极的圆顶。

接下来，用电解质溶液填充储液器。将较大的O形圈放在电极盘周围的凹槽中。然后将圆盘安装到电极室中，并将其连接到控制单元。

向反应室中加入两毫升空气饱和去离子水，并将聚四氟乙烯包覆的磁铁加入反应室。完成后，将腔室连接到控制单元的后部。将温度设置为37摄氏度，搅拌速度设置为100度。

在校准前让系统温度平衡10分钟。确保正确的温度、搅拌速度和压力后，在"校准"选项卡下，选择"液相校准"选项以执行液相校准。然后按确定，并等待信号稳定。

达到平台值后，按 OK。然后加入约20毫克的二亚硫酸钠，在腔室中建立零氧。再次按"确定"，并等待信号稳定，然后单击"保存"按钮接受校准。为了制备四苯基膦或TPP选择性电极组件，使用注射器和柔性针头用10毫摩尔TPP溶液填充TPP选择性电极尖端。

在填充电极尖端时避免气泡。拧松电极支架盖，将内部参比电极插入 TPP 尖端。完成后，组装TPP选择性电极装置，包括参比电极和电极支架。

拧紧盖子以固定尖端。然后将电缆连接到控制箱的辅助端口和TPP电极支架。将 TPP 选择性电极和参比电极插入适合的离子选择性电极的柱塞组件中。

将参比电极连接到控制箱的参比端口。接下来，为了制备反应室，向反应室中加入一毫升反应混合物而不会产生气泡。使用经过调整的柱塞组件关闭腔室，并放置TPP选择性电极和参比电极。

关闭腔室后，使用用塑料管修饰的单独微型注射器将其他试剂直接引入反应室。设置准备就绪后，选择"转到"以开始录制。获得稳定的电压信号后，通过添加0.1毫摩尔TPP溶液的一个微摩尔增量来校准TPP选择性电极，以实现3微摩尔的最终浓度。

观察每次添加时TPP电压信号的对数下降。稳定氧气和TPP痕量后，通过柱塞组件中的试剂加成端口将100微克新鲜制备的心肌细胞线粒体加入反应室，最终浓度为每毫升0.1毫克。观察腔室中氧气水平的降低，因为线粒体变得通电并消耗氧气。

另外，当线粒体产生膜电位并从溶液中吸收TPP时，TPP电压信号的突然增加。然后每毫升少霉素加入2.5微克以诱导4国度呼吸。为了评估线粒体通透性转变孔隙（mPTP）的开放概率，观察泄漏呼吸期间膜电位随时间推移的下降。

一旦达到所需的膜电位，向反应室中添加一个微摩尔环孢菌素A作为mpTPP抑制剂，以评估该特定膜电位下mpTPP的开放概率。然后测量环孢菌素A添加前后环孢菌素A对氧消耗量和膜电位的影响。在同时耗氧和膜电位的代表曲线中，相对于两个微摩尔TPP校准水平，高膜电位设置为零，中间设置为5，低至10毫伏。

零毫伏时线粒体表现出100%mPTP闭合概率，10毫伏时表现出100%的开裂概率。添加寡霉素后，未观察到耗氧量的显着差异，这表明三磷酸腺苷或ATP合酶对2型呼吸的贡献最小。此外，还比较了环孢菌素A加入前后的耗氧率和膜电位。

耗氧速率的降低和膜电位稳定性的增加表明开放性mpTPP的闭合。当mpTPP关闭时，耗氧率没有降低，膜电位继续下降。结果在FVB对照和高膜电位和低膜电位和Fmr1敲除心脏线粒体中表现出相似的闭合和开放mPTP概率。

在中间膜电位处，与FVB对照组相比，Fmr1敲除心脏线粒体显示出增加的闭合mPTP概率。不得将气泡引入腔室，因为这将导致耗氧读数不稳定，并使解释变得困难。按照该程序，可以测量钙负荷能力。

这种方法评估了孔隙的高电导率开口，并补充了我们技术的结果。