使用多模态非线性光学显微镜对纳米颗粒的细胞摄取进行生物分子成像

我们的协议提出了一种多模态、非线性的光学显微镜，并将其应用于对癌细胞中的金纳米颗粒进行化学特异性成像。我们的成像系统的主要优点是它可用于以多模态方式查看细胞结构和金纳米颗粒的生物分子对比度。首先，打开除遥控盒以外的所有设备的插头。

然后，打开盒子背面，在控制盒上的远程指示灯变为蓝色后按开始操作。然后，打开激光扫描显微镜的PC并运行共聚焦显微镜软件。然后，使用计算机软件检查显微镜的光路，并通过触摸屏或遥控旋钮或计算机软件控制焦点。

在软件中选择所需的图像设置，包括缩放、图像大小（以像素为单位）和像素停留时间，同时确保像素停留时间大于积分时间。将一滴蒸馏水放在水浸物镜的顶部，将激光束聚焦到样品中以及聚光镜和样品之间进行成像。然后，将聚光镜的高度调整到样品上方约一毫米以收集最大光量，并将放置在可移动支架上的SRS检测器移出光束路径，以使用白光聚焦在样品上。

使用软件设置，选择泵浦光束并将激光波长更改为 802 纳米（CH 振动）和 898 纳米（酰胺 I 峰），从而考虑拉曼位移的较大变化。要实现拉曼位移的微小调整，请按照手稿中所述扫描SFTRU单元中的延迟级。对于高光谱数据集，请选择"触发器"选项卡，单击"通过 ttl 触发器启动"，然后选择"每帧触发一次"。

接下来，在"序列"选项卡中，将时间序列设置为打开，将 Z 系列设置为关闭。此外，设置时间序列中的帧数以匹配 ATM 软件中的步数。接下来，转到ATM软件中的"运行"选项卡，将CH的延迟阶段位置设置为90.25和92.25，而酰胺I区域的延迟阶段位置设置为89和91，以毫米为单位，对应于高光谱扫描的开始和停止位置，同时确保步数与计算机软件中的帧数相匹配。

检查正确的设置后，首先转到"获取"，然后单击"开始扫描"，从而在计算机软件中启动高光谱堆栈。然后，在ATM软件中，单击开始，这将启动一系列图像的收集，并在所选开始和停止位置之间的延迟级位置上增加增量。然后，在不同的延迟阶段位置拍摄图像的时间序列以生成高光谱扫描。

使用模拟单元，在SFTRU系统之间发送和接收ttl信号，以同步图像采集和延迟级的移动。为了在CH振动区域的成像与酰胺I振动区域的成像之间切换，请将激光软件中的泵浦波长从802纳米更改为898纳米。此外，将 ATM 软件中的斯托克斯色散设置从 30 毫米更改为 5 毫米。

通过增加数量改变镜子角度，调整镜座上的下旋钮，对 SFTRU 箱内泵浦光束扩散通道中的镜子进行小幅调整。为了验证聚苯乙烯微球的化学选择性，记录了高光谱受激拉曼散射和自发拉曼光谱。除了观察到的相对强度差异外，光谱是相同的。

4T1癌细胞的受激拉曼散射成像在2，852，2，930和2，968波数下进行，对应于脂质，蛋白质和DNA生物分子的碳氢拉伸振动带。对给予金纳米颗粒的4T1癌细胞进行多模态成像，以研究癌细胞中的纳米颗粒分布。获得了CH2和CH3通道、LysoTracker荧光探针和离共振受激拉曼散射通道的受激拉曼散射图像。

要记住的最重要的事情是更改激光软件中的振动区域、泵浦参考以及协议期间的斯托克斯色散设置。该系统可以轻松地从飞秒切换到皮秒区域，而不会影响光学对准。这种能力使我们能够执行多光子相干拉曼散射和泵浦探针光谱及其应用。

这种多模态成像平台为纳米医学提供了新的见解，并为细胞、组织和金纳米颗粒的分子成像铺平了道路。