发育（青蛙）胚胎中的细胞谱系引导质谱蛋白质组学

这种谱系指导的方法能够对脊椎动物胚胎内具有空间和时间分辨率的重要发育事件进行蛋白质组学分析，从而传递无法通过全胚胎测量获得的信息。这种方法可以很容易地扩展到研究来自不同胚胎细胞的蛋白质、代谢物和转录物，因为它们在发育过程中分化。这种方法可以促进我们对控制正常和疾病发展的分子机制的理解，包括早期发育期间组织诱导和细胞命运承诺的机制。

使用毛环将每个胚胎引导到孔中并轻轻定位它们，使感兴趣的目标细胞与微针成直角。按照非洲爪蟾组织命运图谱，鉴定目标谱系的前体细胞。使用两个锋利的镊子轻轻去除胚胎周围的卵黄碱膜。

通过使用镊子手动解剖从胚胎中分离单个细胞。首先设置含有谱系示踪剂溶液的注射针。将显微注射针安装到由多轴微型机械手控制的微量移液器支架中。

将微量移液器支架连接到微量注射器，并通过施加负压将血统示踪剂填充针头。校准针头并调整针尖的大小和注射时间，以提供大约一纳升在矿物油中测量的谱系示踪剂溶液。确保注射的液滴尺寸准确，并根据需要调整注射器设置。

用3%fCAL溶液淹没显微注射粘土培养皿，并使用移液管将大约10个胚胎转移到粘土培养皿中。向感兴趣的细胞注射约1纳升荧光葡聚糖或200皮克GFP mRNA。使用体视显微镜，确认细胞标记的成功。

确保仅注入预期的细胞。按照机构政策丢弃含有受伤或错误标记细胞的胚胎。将注射的胚胎转移到含有0.5x斯坦伯格溶液的培养皿中。

在14至25摄氏度之间培养它们，直到它们达到所需的发育阶段。将三到五个胚胎转移到含有0.2x Steinberg溶液的琼脂培养皿中进行微解剖。使用镊子从胚胎中解剖标记的克隆。

用0.5至10微升移液管收集解剖的组织，并将其放入微量离心机文件中。使用移液器吸出收集的组织周围的培养基以限制样品中的盐分，以避免干扰HRMS分析。通过将样品瓶放在干冰或液氮上，立即冷冻分离的细胞。

将样品储存在零下80摄氏度，直到质谱分析。对于通过CE进行单细胞样品处理，通过将样品加热到60摄氏度约15分钟来使蛋白质变性。然后将样品平衡至室温五分钟，并将胰蛋白酶添加到样品中进行消化。

对于NanoLC分析，在50微升裂解缓冲液中裂解多达五个解剖组织。通过上下移液样品来简化该过程。为了处理解剖的组织，将裂解物在4摄氏度下孵育10分钟。

然后在4， 500 RCF下离心，在4摄氏度下沉淀细胞碎片和卵黄血小板。将上清液转移到干净的微量离心瓶中，并加入10%SDS，以获得裂解物中1%SDS的终浓度。对于组织，向裂解物中加入0.5摩尔二硫苏糖醇以获得约25毫摩尔的终浓度。

然后将裂解物在60摄氏度下孵育30分钟，以化学方式减少蛋白质中的二硫键。加入0.5摩尔碘乙酰胺以获得裂解物中约75毫摩尔的终浓度，并将混合物在室温下在黑暗中孵育15分钟。加入与初始体积相同的0.5摩尔二硫苏糖醇，以淬灭烷基化反应中残留的反应物。

如文本协议中所述，在丙酮中沉淀蛋白质过夜，并在0.5摩尔碳酸氢铵中复溶。加入胰蛋白酶进行样品消化，并将小瓶在37摄氏度下孵育。要使用CE分离肽，请重新配制成一至两微升样品溶剂中消化的蛋白质。

涡旋混合样品并在 10， 000 RCF 下在 4 摄氏度下离心两分钟以沉淀细胞碎片。通过用BGE冲洗CE毛细管来初始化CE-ESI仪器。将一微升样品放入样品瓶中，并通过流体动力注射将1至10纳升样品注入CE分离毛细管中。

将CE分离毛细管的入口端转移到BGE中。通过逐渐从接地斜坡上升CE分离电压来开始电泳分离。电流低于 10 微安的 20 至 28 kV 电位可确保稳定且可重复的分析仪器性能。

要使用Nano LC进行分离，请将肽样品重新悬浮在流动相A中，样品的浓度和进样体积取决于可用的LC系统和色谱柱。将样品转移到液相色谱瓶中。将大约200纳克至2微克的肽样品加载到C18分析柱中，并使用文本手稿中所述的梯度洗脱以每分钟300纳升的流速分离肽。

使用相机检查通过电喷雾发射器的液体流量，并目视检查设置是否存在可能的泄漏。获取质谱事件并按照文本手稿中的描述对肽进行测序。使用CE-ESI-HRMS从不同胚胎解剖的D11细胞之间检测到基因翻译差异。

通过LC-HRMS分析谱系标记的解剖细胞克隆。蛋白质的通路分析显示，Spemann组织者与神经外胚层的蛋白质翻译和能量代谢上调。神经外胚层富含与细胞中蛋白质货物的核转运相关的蛋白质，这可能表明信号传导后的下游事件。

分子功能的富集分析表明，蛋白酶体复合物的翻译起始、RNA结合和结合上调，表明Spemann组织者的动态蛋白质周转具有作用。仅为该协议选择刻板的胚胎，以提高可重复性和结果解释。解剖的组织应转移到小瓶中并立即冷冻，其中包含尽可能少的培养基缓冲液，以尽量减少缓冲盐的污染。

这种方法使我们能够研究活胚胎中已鉴定细胞和细胞谱系中的蛋白质动力学。我们获得的关于发育组织中重要蛋白质的空间时间产生的新信息使我们能够设计有针对性的实验来评估它们的生物学功能。