使用茜素红染色检测斑马鱼幼虫中化学诱导的骨质流失

这种方法可以帮助检测斑马鱼中化学物质引起的骨毒性。固定组织的茜素红染色可产生骨骼变化的永久记录，便于比较多个标本。该技术可能有助于研究斑马鱼模型中的骨质疏松症，因为骨质疏松症的特征之一是骨量的减少。

受精后9天从每组中随机取出10只斑马鱼幼虫，并将鱼固定在一毫升2%多聚氰醛和1X PBS中两小时。倒出溶液，并使用pH值为7.5或10毫摩尔的100毫摩尔Tris HCL洗涤斑马鱼幼虫。为了脱色，倒出溶液并将幼虫在手稿中所述的一系列溶液中孵育五分钟。

最终孵育后，倒出溶液并通过用由3%过氧化氢和0.5%氢氧化钾组成的溶液漂白除去色素。每10分钟观察一次，直到色素完全去除。用25%甘油，0.1%氢氧化钾冲洗斑马鱼幼虫几次，每次10分钟，直到没有气泡。

通过浸泡一毫升0.01%茜素来染色幼虫。倒出溶液，加入一毫升50%甘油或0.1%氢氧化钾以清除背景。将鱼储存在新鲜的50%甘油或0.1%氢氧化钾中，以供随后观察。

一次将一只幼虫转移到载玻片上，将幼虫保持在液滴的中间。在体视显微镜下观察幼虫。打开相机。

打开软件，并保留默认设置。单击AE并选择合适的曝光时间以获得最佳图像。在相同设置下捕获所有图像。

将图像保存为点 tiff 格式以供以后分析。双击图像J图标。要分析保存的图像，请单击文件，然后打开，然后单击图像，然后键入并选择八位。

单击编辑，然后反转。单击分析，然后校准。在弹出界面中选择未校准的OD。

检查下方界面左下角的全局校准，然后单击确定。单击分析，设置比例，然后删除比例。选中下面的全局，然后单击确定。

单击分析，然后设置测量值。在弹出界面中选择项目区域。检查下面的阈值限制以仅测量所选范围，然后单击确定。

单击图像，调整，然后单击阈值，然后在弹出界面中间滑动滑块。选择适当的阈值，以便在一个图像中选择要测试的所有目标。然后单击设置。

单击分析，然后测量，保存日期。茜素红染色是测量斑马鱼幼虫骨矿化变化的灵敏和特异性方法。受精后9天，头部骨骼的许多骨骼，如蝶旁骨、眼膜骨、角分支骨和脊索骨被矿化，因此染成红色。

相比之下，耳石等非骨结构呈现棕黑色。为量化总染色面积而进行的数字分析显示，每升醋酸铅处理组10和20毫克的染色面积显着减少。骨矿化的变化表现出剂量依赖性。

为了获得更好的染色效果和观察效果，重要的是去除斑马鱼幼虫的原始色素，并在漂白后去除气泡。