用于确定未知 尖孢镰刀菌 f.sp的种族的三种接种技术的对比。 尼维姆 分离

该协议可以帮助参与西瓜社区的人评估镰刀菌枯萎病病原体，这将有助于确定存在的病原体种群并帮助有效管理它。种族分型镰刀菌枯萎病的完成过程复杂且耗时，并且具有三种可行的种族分型生物测定选项将允许用户选择最适合其实验条件的方法。所有这三种方法都有助于植物健康从业者诊断与特定分离株相关的镰刀菌枯萎病感染的潜在严重程度。

这些信息有助于做出明智而有效的综合疾病管理决策。要开始种植准备，请用种植培养基填充8x16细胞开始，同时向下敲击以压缩土壤。然后，播种，其顶点指向与长度相等的深度。

播种后，用富勒的泥土覆盖含有埋藏种子的培养基至0.3175至0.635厘米的深度，然后将平整雾化以抑制培养基，而不会产生站立或积水。之后，每180分钟喷雾20秒，持续五天，直到种子发芽，保持培养基湿润。发芽后，每天浇水一次。

种植后五天，将直径为1至1.25厘米的浸润纸盘（含有优选的尖孢镰刀菌分离物）放入一种澄清的V8果汁培养基和1/4强度的马铃薯葡萄糖琼脂或QPDA培养基板上，将其储存在28摄氏度的培养箱中8天。在第八天，将V8和QPDA板转移到生物安全柜中，然后通过在培养基表面上刮下无菌细胞播撒器并将液体分生孢子悬浮液池池到无菌的50毫升培养管中来移位分生孢子。接下来，通过将计算的约100万个孢子的体积转移到新鲜的无菌培养管中并用无菌去离子水使总体积达到30毫升来量化孢子计数并制备最终的接种液溶液。

为了准备接种，将6x12细胞泡沫塑料平板预先用10%漂白剂消毒并冲洗干净以接受接种的植物。接种前几个小时，彻底浇灌植物。浇水两小时后，从8x16细胞泡沫塑料平板上取出试管苗并冲洗其根部。

然后，将冲洗过的植物暂时存放在干净的容器中，用自来水直至使用，使品种彼此分开。之后，将幼苗分成六个个体，并将幼苗组用湿纸巾包裹在实验室托盘上。在6x12阵列聚苯乙烯泡沫托盘的每个电池的底部放置25至30立方厘米的土壤，并使用喷射瓶将土壤弄湿，直到土壤明显潮湿。

从健康对照开始，将一组同一品种的未损坏的六株幼苗放入含有接种物的50毫升管中。为了接种疫苗，将根部浸没30秒的试管婴儿管涡旋。接下来，将每个细胞的单个试管苗放在6x12发泡胶平板中，将同一品种的植物放在托盘的一列中。

用种植培养基覆盖试管苗，轻轻定型。使用注射器用20毫升水润湿试管苗，同时避免飞溅。当所有幼苗都重新种植后，将试苗放在平均温度为27摄氏度的封闭黑暗环境中过夜。

为了侵扰果仁，通过在QPDA板上分离和培养尖孢镰刀菌菌株以使其生长覆盖板的一半来制备接种物。通过将无菌的自来水添加到装有200克内核的一升玻璃锥形瓶中来制备内核，以完全覆盖至少五厘米的谷物。将果仁在24摄氏度下浸泡在烧瓶中两小时后，从烧瓶中沥干水分，用一块用奶酪布包裹的棉卷堵住烧瓶的开口，然后用铝箔包装覆盖开口。

在高压釜中以重力循环对烧瓶进行灭菌一小时，干燥时间为五分钟，然后让烧瓶冷却至室温。将谷物转移到带有过滤器的蘑菇生长袋中。从袋子中取出空气，然后将多余的塑料折叠在袋子周围。

将袋子放在塑料高压灭菌器安全的垃圾箱中，并用铝箔包装覆盖垃圾箱，然后使用与以前相同的设置再次高压灭菌。高压灭菌后，让真菌在袋中的内核上孵育三周。使用四号尺寸的无菌软木孔，从培养板上的活性生长区切割直径六毫米的琼脂盘。

展开袋子，用严格的无菌技术放置五个琼脂盘。使用无菌的50毫升量筒测量并向袋中加入35毫升无菌自来水。用灌封混合物填充塑料罐，然后将测量量的灌封混合物加入装有14粒受感染内核的大塑料袋中。

在袋子里做一个气垫，并在混合内核和土壤之前通过多次倒置袋子将其密封。完成后，用受感染的土壤混合物填充表面灭菌的锅。对每个剩余的西瓜品种重复该过程，每个被测试的分离物总共四个完整的受感染土壤罐。

接下来，在锅中播种六粒西瓜种子，种子的顶端朝上。使用喷雾瓶，用水润湿上部0.3至0.6厘米的土壤，然后在每个锅的下方和上方放置一个透明的塑料盘。以4:1:1的比例用蒸汽巴氏杀菌砂，泥炭，蛭石填充48个细胞插入物，然后向下敲击插入物以压缩土壤。

然后，将插入物放入塑料托盘中，并如前所述播种。种植前七天，用浸润的纸张接种五个QPDA板，以14小时/ 10小时的黑暗周期将它们储存在培养区域八天。在第七天，将两个一平方厘米的琼脂塞子转移到每个含有100毫升马铃薯葡萄糖的250毫升锥形瓶中，并将锥形瓶放在台式摇摇杯上。

在接种当天，通过四层无菌奶酪布过滤接种物来收获孢子，以确定烧瓶的微分生孢子浓度。播种14天后，将细胞插入物与幼苗一起转移到织带托盘中，然后将与幼苗一起的织带托盘放入装有七升接种悬浮液的塑料桶中。保持接种物不受干扰15分钟后，将含有接种幼苗的细胞插入物转移到无孔托盘中，并将无孔托盘放在温室工作台上，然后根据需要浇水。

保持前面所述的根浸生物测定的照明和环境条件。根据所使用的方法，通过观察和计算枯萎和植物死亡的发生率来开始评级，并拍摄数字图像来记录疾病进展。在改良的托盘浸渍方法中，感染了race-2分离株的黑钻石和查尔斯顿灰品种表现出严重的症状并死亡。

相比之下，Citrullus amarus PI品种表现出抗性。在根蘸法中，感染了0族分离株的幼苗大多存活下来，而几乎所有感染了第3种分离株的幼苗都死亡。在受感染的内核方法中，在种族2出没的土壤中生长的Sugar Baby和Charleston Gray品种已经开始枯萎和死亡，而Citrullus amarus PI植物仍然看起来很健康。

记住要适当地播种和维持植物，检查病原体分离株的生存能力，了解每种接种方法的独特技术，并在评估疾病症状时保持一致。凭借这些方法的结果，研究人员可以通过测序和比较基因组学分析来研究控制分离株之间差异方差表达的潜在遗传决定因素。使用这些方法，研究人员已经能够评估不同位置不同毒力表型的流行情况，并将这些表型与可观察到的遗传元素进行比较。