使用报告基因表达重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠的病毒感染进行实时成像和定量

我们的实验方案描述了在SARS-CoV-2感染的K18人ACE2转基因小鼠模型中使用荧光或发光表达重组SARS-CoV-2进行体内和离体活体成像病毒检测和病毒追踪。该技术的主要优点是病毒检测和跟踪在K18人ACE2转基因小鼠模型中SARS-CoV-2的体内和离体研究中的应用和可行性。在K18人ACE2转基因小鼠模型中使用SARS-CoV-2的体内成像代表了评估治疗体内SARS-CoV-2感染的治疗方法的绝佳选择。

实施报告者SARS-CoV-2代表了评估体内致病性，病毒复制和营养作用的绝佳选择。对于表达SARS-CoV-2的荧光素酶的体内研究，建议在底物注入后剃须小鼠并立即成像以改善生物发光信号。通过启动体内成像系统或IVIS开始生物发光监测，并设置参数，单击图像模式到生物发光，然后打开滤镜并将曝光时间设置为自动。

接下来，从隔离室中取出已经剃光和麻醉的小鼠，并使用25号针头向后轨道施用100微升在PBS中稀释1至10的荧光素酶底物给小鼠。然后将鼠标放回隔离室，将隔离室转移到IVIS机器上，该机器配备了加热组件以防止体温过低，并通过在软件程序中选择"获取"来关闭IVIS成像器门以初始化成像。要分析采集的生物发光图像，请使用软件中的ROI或感兴趣区域工具来指定精确信号并测量通量。

启动成像软件并设置参数。单击图像模式到荧光，将激发设置为500纳米，将发射滤光片设置为530纳米，并将曝光时间设置为自动。

将切除的肺放入含有两毫升1X PBS的6孔板中，冲洗以除去多余的血液。使用70%乙醇对样品之间的手术工具进行消毒和清洁。初始化IVIS机器后，将肺部放在黑色薄片上，并将组织彼此分开。

然后将托盘放在生物安全柜内的隔离室内，然后将隔离室转移到IVIS。关闭IVIS成像仪门，然后单击"采集"以启动成像系统。要分析荧光，请使用ROI工具并在每个单独的肺周围绘制ROI。

手动测量每个ROI，然后使用给定的平均辐射效率值，并从模拟感染的小鼠中减去。成像完成后，将组织放入冷冻管中进行干冰冷冻，以零下80摄氏度储存，以便以后处理。利用从组织匀浆中获得的上层，进行十倍连续稀释，并用一毫升每个上清液稀释液一式三份感染Vero E6细胞的融合单层。

让病毒在37摄氏度下在加湿的5%二氧化碳培养箱中吸附一小时。完成后，用一毫升1X PBS洗涤细胞，然后将细胞在两毫升含有1%琼脂的感染后培养基中在37摄氏度的加湿的5%二氧化碳培养箱中孵育72小时。孵育后，在10%中性缓冲福尔马林中在4摄氏度下灭活板24小时，确保整个板浸没。

取出生物安全3级的板，在室温下用一毫升0.5%Triton X-100洗涤细胞三次10分钟。接下来，用一毫升2.5牛血清白蛋白或BSA和PBS在37摄氏度下阻断透性细胞一小时，然后在一毫升每毫升一微克的SARS-CoV核衣壳蛋白交叉反应性单克隆抗体1C7C7中孵育，在2.5 BSA中在37摄氏度下稀释一小时。用一毫升1X PBS洗涤细胞三次，并根据制造商的说明使用ABC和二氨基苯或DAB，过氧化物酶底物试剂盒显现斑块，然后将病毒滴度计算为每毫升斑块形成单位。

在研究中，观察到生物发光纳米酸化酶或Nluc很容易被检测到，并且感染了rSARS-CoV-2 Nluc的小鼠，但那些感染了rSARS-CoV-2野生型或模拟感染的小鼠却没有。定量分析显示感染后不同日子的Nluc强度。感染rSARS-CoV-2 Nluc的小鼠肺表面的肉眼病变与rSARS-CoV-2野生型感染组相当。

此外，在感染后不同日期，检测到的病毒滴度和rSARS-CoV-2 Nluc感染小鼠在所有器官中与感染rSARS-CoV-2野生型的小鼠相当。同时，仅在rSARS-CoV-2 Nluc感染小鼠的器官中检测到Nluc活性。另一组模拟感染和病毒感染的小鼠被监测12天，以观察体重和存活率的变化。

感染rSARS-CoV-2 Nluc和rSARS-CoV-2野生型的小鼠体重减轻了高达25%的体重，并且在感染后七到八天内全部死于病毒感染。在rSARS-CoV-2 Venus感染后，在所有肺部很容易检测到感染rSARS-CoV-2 Venus的小鼠的金星表达，但那些感染rSARS-CoV-2野生型或模拟感染的小鼠则不然。定量分析表明，Venus强度在感染后两天达到峰值，并在感染过程中和受感染小鼠的肺部下降。

肺表面图像显示感染rSARS-CoV-2 Venus的小鼠的严重病变与rSARS-CoV-2野生型感染小鼠的严重病变相当。此外，感染rSARS-CoV-2 Venus导致病毒滴度与在所有器官中感染rSARS-CoV-2野生型的小鼠中观察到的病毒滴度相当。感染rSARS-CoV-2 Venus和rSARS-CoV-2野生型的小鼠体重减轻了25%，并在感染后第九天死于病毒感染，没有存活。

报告者表达SARS-CoV-2的结果已被证明是病毒感染的有效替代品。因此，这可能导致快速确定和评估治疗SARS-CoV-2感染的对策。