通过透明硅胶窗进行纵向活体成像

这种铸造和插入有机硅窗口的程序降低了纵向活体内成像的技术障碍。我们的实验方案可生产坚固、易于适应的窗户，动物对它们的耐受性良好。使用这种技术，我们对肝脏，胰腺和乳腺中的癌症和免疫细胞进行了成像。

只需进行最小的调整，它就可以适应许多解剖位置和生物学问题。对于那些第一次尝试这种技术的人来说，练习从注射器中释放少量的胶水。涂上过多的胶水会使成像区域变得浑浊，并使手术区域难以使用。

通过在干净光滑的表面上沉积少量新制备的PDMS有机硅聚合物聚二甲基硅氧烷，开始铸造硅胶窗口，并调整体积与面积比以获得所需的厚度。一旦PDMS沉积在所需的铸件表面上，将不锈钢网格轻轻地压入硅胶中，为相同组织区域的重复成像提供标记。要去除气泡并使有机硅聚合物脱气，请将涂层表面置于真空干燥器中45分钟。

完成后，将聚合物在75至80摄氏度的烘箱中固化45分钟。将聚合物划在模具的边缘，并使用镊子从用于铸造的表面轻轻剥离固化的窗口。将鼠标放在左侧侧卧位。

通过在剃须的手术部位连续三次施用10%体积的聚维酮碘溶液和70%体积的乙醇来制备用于手术的麻醉小鼠进行手术。必须注意保持无菌手术区域。接下来，使用无菌剪刀和镊子在肋弓下方三毫米处的右侧侧部做一个10毫米的切口。

取出皮肤的一平方厘米部分，并使用第二对无菌剪刀和镊子去除腹膜部分略小于皮肤部分的部分。将少量手术粘合剂沉积在无菌孔板上，并用31号注射器将其取出，以涂敷在要成像区域边缘周围的肝脏表面上，然后将窗口定位在所需区域上，并将其牢固地固定在肝脏上约两分钟，直到粘合剂干燥。将窗的边缘折叠在腹膜下后，将少量的手术粘合剂沉积在窗的边缘上，这些粘合剂现在位于腹膜下方，用镊子向下推腹膜以将其固定在窗户上。

同样，在向下推皮肤之前，通过沉积少量的手术粘合剂来密封腹膜，然后在窗户边缘周围涂上胶水以形成一个边缘，以防止皮肤在窗户上长回来。要将窗口插入胰腺，请将鼠标放在右侧外侧褥位，并在左侧侧翼做切口，然后切除腹膜的一部分，如前所述。使用浸泡有无菌盐水的无菌棉签，轻轻拉动脾脏以观察胰腺。

用湿润的棉签重新定位胰腺，使更多的表面积通过切口可见。进入胰腺后，如前所述，将成像窗口插入并密封在所需区域。要进入乳腺，将小鼠置于仰卧位，并使用无菌剪刀和镊子在其中一个腹股沟上做一个 10 毫米的切口。

取下乳腺上方0.5平方厘米的皮肤部分，然后通过在两个表面之间铺开无菌剪刀以破坏粘附，轻轻地将乳腺与皮肤分开。使用31号注射器在要成像的区域边缘周围的乳腺表面上施加少量的手术粘合剂。将窗口定位并牢牢地靠在乳腺上，直到粘合剂变干。

将窗户的边缘折叠在皮肤下后，在现在皮肤下方的窗口边缘上沉积少量手术粘合剂，并用镊子向下推皮肤以将皮肤固定在窗口上。在窗口边缘周围涂上胶水以创建一个边缘，以防止皮肤在窗口上长回来。在开始成像之前，用浸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭窗口，以清除任何残留的碎屑。

使用水浸透镜时，将超声波凝胶涂抹在窗户上，避免气泡。要开始成像，请通过目镜定位并放置对焦网格。然后通过将网格的底部设置为零来确定近似的组织成像深度。

该信息将有助于在后续成像会话中定位相应的Z平面。要在多个成像会话中识别同一位置，请使用网格上的方块作为参考点。在成像会话期间，请注意网格方向和网格内成像的每个视场的位置。

网格可用于在映像会话成功时导航回特定的网格区域和成像区域。每次成像后，用浸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭窗口，去除任何残留的镜头浸入介质和碎屑。硅胶窗口可以捕获随时间推移的动态免疫细胞浸润。

具有代表性的分析说明了第二天和第四天重塑乳腺组织内的中性粒细胞浸润。硅胶窗口允许在窗口插入后几周内在多个时间点可视化肿瘤。用200毫克PDMS铸造的窗户通常更适合手术植入，因为它们表现出比150毫克铸造的窗户更大的韧性。

值得注意的是，PDMS窗户不像标准玻璃那样刚性，其表现为玻璃窗的杨氏模量明显大于PDMS。不同器官的窗口插入耐受性良好，因为大多数小鼠随着时间的推移体重继续增加。尝试此过程时要记住的最重要的事情是使用胶水完全密封窗户。

这可以防止感染，组织干燥和窗户移位。手术后，可以通过硅胶窗口进行原位注射，使研究人员能够研究各种主题，例如细胞增殖，细胞 - 细胞相互作用和治疗效果。