使用GCaMP3报告器测量心脏特异性钙通量，对心脏重编程进行体外评估

该协议中描述的方法将为评估用于心脏重编程研究的ICM的功能成熟提供有价值的平台。钙通量仅在ICM中观察到，并提供了一种评估ICM功能成熟的方法。这种小鼠品系简化了评估程序，提高了结果的可重复性。

该协议是评估ICM在心脏重编程领域的功能成熟的新方法。也可用于评价心肌细胞分化和心功能。首先获得8至10只幼崽，P0至P2幼崽以分离1000万只新生儿心脏成纤维细胞或NCF。

通过体温过低深度麻醉幼崽。在荧光显微镜下观察心脏，以确保具有所需基因型的心脏显示钙通量，由GCaMP3指示，心脏跳动。其他基因型不会显示荧光。

在隔离心脏后，将它们切成四块，使它们松散地连接在一起。在冰冷的Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水或DPBS中，在六厘米的板中彻底洗涤它们几次，以限制分离细胞中的血细胞污染。用8毫升温热的0.25%胰蛋白酶-EDTA在37摄氏度下消化心脏10分钟。

丢弃胰蛋白酶上清液，在Hank的平衡盐溶液中加入每毫升0.5毫克的温热型二型胶原酶。彻底涡旋混合物，并在37摄氏度下孵育五分钟。孵育后，再次彻底涡旋混合物，让未消化的组织通过重力沉降下来。

将上清液收集在带有5毫升冷成纤维细胞培养基的15毫升锥形管中。用成纤维细胞培养基稀释细胞，使得接种密度约为每立方厘米10至第四个细胞的2至2.5倍。然后将细胞接种在培养皿或盘子中。

附着的成纤维细胞在播种后的第二天应具有椭圆形至圆形。在第0天，将NCF接种到大约1到2倍的密度，每立方厘米10到第四个细胞在成纤维细胞培养基中。在第一天，根据需要将培养基替换为每个孔中含有病毒的培养基。

在病毒感染后的第2天，24小时，用常规ICM培养基替换含有病毒的培养基。在室温下用倒置荧光显微镜评估钙离子通量。在10X物镜下观察GCaMP3阳性细胞，确保它显示自发细胞在明场通道中跳动。

具有正确基因型的心脏显示钙离子通量与跳动同步，可视化为GCaMP3荧光。虽然在对照心脏中没有观察到荧光。分离的NCF在两小时内附着在井上，并在播种后一天显示出椭圆形至圆形。

钙离子振荡表明GCaMP3荧光在最大和最小值之间变化，并且这些细胞的钙离子振荡周期性变化。引入IMAP后，由于IMAP培养基处理组具有高功率场钙离子通量的GCaMP3阳性细胞数量增加，跳动簇数显著高于对照组。NCF在隔离后应新鲜准备和健康。

快速的心脏隔离，切割和适当的消化时间可以帮助避免细胞活力和状况的降低。该方法为心脏重编程研究人员提供了一种识别功能性饱和ICM的方法。通过多种进一步的评估方法，人们可以更简洁地了解功能性饱和ICM。