大小排除色谱分析细菌外膜囊性异质性

大小排除色谱是分离异质大小细菌囊泡亚聚合物和从细菌超分子中去除核酸和蛋白质的有用方法。与其他分离技术（包括密度梯度超中心化）相比，尺寸排除色谱更便宜、更快、更可重复。我们已经证明了这种方法使用A.actinomycemcomitans囊泡的潜力，但我们预计，它可以应用于其他异质大小的细菌囊泡种群。

请务必正确解毒所有缓冲器和珠子溶液，并在不引入气泡的情况下缓慢地移液，但速度足够快，使珠子在不干燥的情况下均匀地包装。首先，使用玻璃棒将一瓶凝胶过滤介质混合，并将填充柱子所需的体积加上大约 50% 的超量倒入玻璃瓶中。让珠子沉淀并排出多余的液体。

将珠子重新用于弹性缓冲，最终溶液的凝胶约为 70%凝胶和 30%缓冲，并在真空下解压溶液。将柱子安装在垂直位置的环形立柱上，用弹性缓冲器填充柱子，以弄湿墙壁，然后排出缓冲器，直到只剩下大约一厘米。然后小心地将凝胶珠移入柱子中，同时排空多余的缓冲器，以防止珠子沉降，直到柱子被包装到柱子底部下方约两厘米的高度。

在加载样品之前，在真空下对弹性缓冲进行除气。用大约两倍于列体积的洗涤柱子。一旦缓冲器到达凝胶层顶部，小心地在凝胶层顶部添加每升外膜囊泡样品的 100 到 200 纳米摩尔的两毫升，而不会干扰表面，让样品进入凝胶。

慢慢地将椭道缓冲器添加到柱子上，而不会干扰凝胶层，并在柱子下放置一根 50 毫升的管子。为了防止柱子干燥，同时在柱子顶部添加洗礼缓冲器。收集 20 毫升 eluate 后，将 1.5 毫升管的架子放在柱子下。

在每个管子中总共收集 96 个一毫升分数。在收集样品时，不断在柱子上添加缓冲。要清洁柱子，通过柱子运行一列体积为 0.1 摩尔氢氧化钠，然后运行两列体积的洗脱缓冲。

为了测量脂质浓度，移液器将每个微分的50微升放入96井板中。在每口井中加入2.5微升脂质染料。15 秒后，测量荧光强度。

为了测量感兴趣的蛋白质的浓度，在 ELISA 免疫板的单独井中加入每个分数的 100 微升。在摄氏25度下三个小时后，盘子里的东西就倒了。每次洗完后，用 200 微升 ELISA 洗涤缓冲器清洗盘子五次。

在25摄氏度的高温下，在每口井中加入200微升阻隔缓冲器，进行一小时的孵化。在孵化结束时，将板倒入，在4摄氏度的隔夜孵化中加入100微升原发抗体。第二天，用 ELISA 洗缓冲器将盘子倒掉并洗五次。

最后一次清洗后，在 ELISA 洗涤缓冲器中加入 100 微升二级抗体，在 25 摄氏度下每口井中孵育一小时。在孵化结束时，按演示方式清洗板，并在每口井中加入 100 微升 TMB 溶液，在室温下孵育 15 至 30 分钟。当蓝色形成时，在每口井中加入50微升停止溶液，并测量450纳米的吸收量。

经过大小排除列纯化A.actinomycecomitans培养超高分子，如所示，观察到两个不同的脂质峰值，对应于该菌株产生的大大小小的外膜囊泡。ELISA对样本分数的分析表明，毒素主要与大外膜囊泡的亚聚合有关。免疫污点分析给出了类似但更嘈杂的结果，表明这种方法不如 ELISA 敏感。

观察到，这种色谱技术能够从外膜囊泡的制剂中去除大量的自由蛋白质。然而，必须指出，蛋白质总浓度不一定与特定蛋白质的浓度相关。在柱子的包装和运行过程中要非常小心，以避免气泡，并防止柱子干涸。

动态光散射、粒子跟踪和双体镜可按照尺寸排除色谱进行，以确定分离的外膜囊泡的大小和其他特征。