嗨，在本视频中，我们将向您展示如何在病毒感染时探索m6A和m5C表徵组。要开始实验，您需要5000万个细胞用于未感染者，5000万个细胞用于受感染情况。为了在分析时获得高质量的数据集，您需要实现普遍感染。
在这里，我们用基于HIV的载体感染这些细胞，并通过FACS测量病毒编码的GFP。在这种情况下，我们有80%的受感染细胞，并继续从总RNA提取开始的工作流程。因此，我们将细胞分成1000万等分试样，并将它们裂解在1mL的Trizol中。
然后，我们向细胞裂解物中加入200微升氯仿，并通过倒置混合。此时，我们让裂解物在室温下静置三分钟，然后在四度下高速离心所有样品15分钟。您将期望看到三个不同阶段的相分离，如图所示。
RNA位于上相中，因此注意不要转移有机层，小心地将水相转移到新鲜的管中。此时，向水相中加入0.5mL异丙醇，并通过倒置小心混合。然后，可以在80度下将样品孵育一小时，以确保RNA沉淀。
在高速离心时，您应该能够看到一个漂亮的RNA沉淀，如图所示。通过倒置或移液小心地丢弃上清液，注意不要破坏沉淀。然后用一mL的75%分子级乙醇洗涤RNA沉淀。
并短暂地涡旋样品。离心后，确保取回一个漂亮的白色RNA沉淀。弃去上清液，让RNA沉淀在室温下干燥15分钟。
将每个沉淀重悬于20微升水中，并将来自相同条件的所有样品聚集在一起。总RNA现在已准备好通过poly-A选择进行mRNA分离。对于每个75微克RNA样品，制备200微升寡核苷酸-DT磁珠，并在一mL结合缓冲液中洗涤。
将管子放在磁性支架上，让磁珠在一次混合过程中与磁铁结合。弃去上清液并重复该过程进行第二次洗涤。然后从磁性支架上取出磁珠，并小心地将它们重悬于100微升的结合缓冲液中。
此时，通过将RNA样品除以75微克RNA来制备，每等分试样重悬于100微升水中。加入100微升结合缓冲液，并在65度下孵育两分钟。然后旋转样品并在冰上孵育。
然后将100微升洗涤的磁珠加入每个RNA样品中，并在室温下在旋转轮上结合15分钟。孵育后，将管子放回磁性架中，让它们孵育一分钟。然后将上清液回收到新鲜管中，并将其放在一边进行第二轮隔离。
用200微升洗涤缓冲液洗涤珠子两次，然后进行洗脱。为了从磁珠中洗脱出聚A选择的RNA，向每个样品中加入20微升冰冷的TRIS HCl并小心移液。然后将样品在80度下孵育两分钟，以释放珠子中的RNA。
将含有聚-A所选RNA的上清液转移到新鲜管中，小心避免珠子残留。洗脱步骤和分离步骤应重复两次，以提高mRNA产量。mRNA现在已经准备好在片段化步骤进入meRIP-Seq管道或直接进入亚硫酸氢盐转化。
进入meRIP-Seq管道的第一步是mRNA片段化。为此，您需要将5微克mRNA分成18微升等分试样，装在0.2 mL管中。为了确保数据的一致性，快速工作并且当时只有很少的样本至关重要。
对于该实验，已经优化了片段化，以获得大小在115至200个核苷酸之间的片段。然后将两微升片段化试剂加入到每个含有18微升mRNA的管中，小心地将液滴沉积在管壁上。旋转所有样品，以便试剂和RNA同时接触，并在70度下孵育15分钟。
孵育结束后，通过加入两微升0.5M EDTA停止反应。此时，您可以使用您选择的方法纯化片段化的mRNA，并通过片段分析仪进行RNA质量控制。这一步是可选的，但它允许在参与RNA沉淀之前评估片段的大小。
正如你在第四条泳道中看到的，我们获得了大约150个核苷酸的样本片段。然后，我们继续进行meRIP-Seq。第一步包括将A / G磁珠与抗m6A抗体或IgG对照组组成。
对于每个反应计划，将25微升磁珠转移到新鲜管中。请注意，您将需要至少一个m6A特定条件和一个控制条件。用250微升IP缓冲液洗涤每25微升珠子。
通过上下移液轻轻重悬珠，并将管子放在磁性架上一分钟，以便分离微珠。取出并丢弃上清液，注意不要吸出磁珠，并重复洗涤步骤一次。然后将磁珠重悬于每25微升原始体积的磁珠100微升IP缓冲液中。
每种情况准备并标记一管。在我们的例子中，我们将有两个管子用于受感染的情况，一个用于m6A，一个用于IgG控制，两个管子用于未感染的情况。然后在每个管中加入100微升洗涤的珠子。
磁珠现在已准备好与特异性抗体或IgG对照组配用。向含有100微升洗涤磁珠的试管中加入5微克特异性抗m6A抗体或抗IgG对照抗体。通过将试管在旋转的轮上孵育30分钟，允许抗体 - 微球偶联。
同时，继续进行样品制备。对于每个计划条件，无论是m6A特异性还是IgG对照，您的起始材料将是2.5微克片段mRNA重悬100微升水。为了使最终反应体积为500微升，向每个样品中加入295微升水。
然后加入5微升浓缩的RNA酶抑制剂，浓度为每微升40单位，每个样品的总量为200单位，并轻轻混合。最后向每个管中加入100微升5X浓缩IP缓冲液。样品现在已准备好进行免疫沉淀反应。
从旋转的轮中取出与抗体偶联的磁珠，并将它们旋转下来。然后将500微升先前制备的样品加入到每个100微升的微珠中，并结合特异性抗体。通过上下移液几次轻轻混合，以完全重悬珠子。
在两小时内将它们或您的meRIP反应以四度在旋转的轮上孵育。孵育结束后，将每个管子旋转下来，将它们放在磁性架上一分钟，以便分离磁珠。然后取出未结合的馏分，将其放在新鲜的试管上，并在需要时将其保留以进行进一步分析。
从机架上取下磁铁，将所有样品重悬于500微升IP缓冲液中。通过上下移液小心地重悬每个样品。将磁铁插入架子上，孵育一分钟，然后小心地取出上清液。
重复洗涤两次，然后继续洗脱。对于每对几个样品，m6A特异性和对照，制备含有20毫摩尔纯化m6A的225微升洗脱缓冲液。然后为每个样品加入100微升洗脱缓冲液。
将所有样品在摇臂上以四度孵育一小时。然后将所有富含m6A的RNA样品收集在新鲜试管中，并进行第二轮洗脱。使用您选择的方法纯化富含m6A的RNA，然后此时样品准备好进行文库制备和测序。
为了研究m5C修饰，我们使用亚硫酸氢盐转化。用500纳克聚腺苷化RNA开始实验。虽然是可选的，但在您的样品中添加500皮克的聚A耗尽RNA以确保核糖体的代表性和0.5微升的市售合成序列将允许您在测序时评估亚硫酸氢盐的转化率。
将样品在水中调节至最终体积为20微升，然后向每个样品中加入130微升RNA转化试剂。通过上下移液并向下旋转所有样品来仔细混合，以确保管的侧面没有液滴残留。将所有样品在PCR机中孵育三个周期，变性70度，持续5分钟，亚硫酸氢盐转化54度，45分钟。
通过直接在空柱上添加250微升RNA结合缓冲液和150微升亚硫酸氢盐转化样品来进行柱内脱氨。通过上下移液来混合样品，但请注意不要触摸色谱柱过滤器。直接在色谱柱中向样品RNA结合缓冲液混合物中加入400微升95-100%乙醇。
合上盖子，立即倒置混合。将样品旋转30秒并丢弃流出物。用洗涤缓冲液洗涤色谱柱，然后向每色谱柱的中心加入200微升脱硫溶液。
将所有样品在室温下孵育30分钟。将样品旋转30秒，然后进行两轮洗涤。向每个样品中加入400微升洗涤缓冲液，全速离心30秒并丢弃流出物。
将色谱柱放入新的空管中，并将亚硫酸氢盐转化RNA洗脱成20微升水。通过RT-qPCR控制亚硫酸氢盐转化效率，然后进行文库制备和测序。在生物信息分析之后，以下是使用此工作流程可能获得的结果的一些示例。
在这里，我们比较HIV感染细胞与未感染细胞的上表转录组。感染后 24 小时。在A面板中，您可以看到我们获得的研究结果探索m6A表转录组。
在此图中，我们绘制了meRIP-Seq分析时m6A富集读取。我们可以很好地看到锌指在感染后24小时被高甲基化。我们对图 B.In 图中的m5C表转录组研究进行了相同类型的分析，每个非甲基化胞嘧啶都以红色显示，而已被m5C甲基化的胞嘧啶的比例以蓝色显示。
正如你所看到的，PHLPP1，所有三种胞嘧啶都是在HIV感染后24小时超甲基化的。总体而言，该工作流程允许研究受感染细胞的M6A和m5C上表转录组，也可以应用于病毒颗粒。了解病毒感染能够改变宿主的表观转录组学景观将使我们能够获得新的一层调节。
对病毒感染时差异甲基化转录本的研究当然将为新的治疗干预提供宝贵的资源。在下面的链接中，您可以找到我们的开放获取资源，用于调查HIV感染随时间推移的差异甲基化转录本。
