结合活细胞钙成像，急性胰腺组织切片技术能够以长时间的高分辨率研究细胞间波和多细胞功能连接。该技术的主要优点是速度快，保留了组织结构，并减少了有限的酶和机械应力，同时保持了高产量的组织。通过检测疾病进展过程中的功能和形态变化，该技术有助于我们了解胰腺相关疾病，例如糖尿病。
这种组织切片技术可以应用于大脑，垂体和肾上腺组织，重点是保持细胞间接触，旁分泌相互作用和组织结构。为了准备将琼脂糖注射到小鼠胰腺中，用40摄氏度的液体琼脂糖填充五毫升注射器，并为注射器配备30号针头。用盖子小心地盖住针头后，将注射器针头末端向下放置，将整个体积的琼脂糖放在水面以下，在40摄氏度的水浴中。
在气压和室温下以每分钟1.5毫升的速度在冰上连续在冰上用碳原泡一瓶细胞外溶液，以确保氧合和7.4的pH值。为了进行琼脂糖注射，将安乐死的成年小鼠置于体视显微镜下，并通过剖腹手术进入小鼠腹部。轻轻地将肠道向左侧移动以暴露胆总管，并使用镊子稍微抬起导管的十二指肠末端以定位Vater的。
使用止血剂将胆管夹在十二指肠处，以防止琼脂糖从胆管泄漏到十二指肠，并使用小的尖锐镊子到达胆总管下方，以破坏将胆管连接到胰腺组织的膜。从胆管中清除尽可能多的脂肪和结缔组织后，将导管垂直于一对较大的镊子的尖端，并牢牢按压注射器柱塞，将粘稠液体琼脂糖注射到胆总管的近端20至30秒。当组织变白并略微膨胀时，取出注射器并缓慢将20毫升起泡的冰冷细胞外溶液倒入胰腺上以冷却组织并使琼脂糖变硬。
为了获得胰腺组织切片，使用镊子和细小的坚韧切割剪刀将琼脂糖注射的胰腺轻轻地转移到含有40毫升冰冷细胞外溶液的100毫米培养皿中。旋转培养皿以冲洗组织并将胰腺转移到第二盘冰冷的细胞外溶液中。使用镊子和剪刀将白色的，注射良好的胰腺部分切成多达六个0.1至0.2立方厘米的碎片，并从组织碎片中取出任何剩余的结缔组织和脂肪组织。
将清洁的块放入35毫米不粘的底部培养皿中，其中含有约5毫升40摄氏度的液体琼脂糖，并立即将培养皿放在冰上。当琼脂糖变硬后，将培养皿倒置在100毫米培养皿的盖子上，并使用剃须刀片的一半小心地切入培养皿的侧壁和琼脂糖之间的边缘，以从培养皿中除去琼脂糖。使用剃须刀片从游离的琼脂糖中切割单个立方体，每个立方体含有一块琼脂糖组织块，并使用氰基丙烯酸酯胶将块连接到振动切片机的样品板上。
用150毫升冰冷的细胞外溶液填充振动切片机的切割室，这些溶液连续用碳原起泡。用螺钉将样品板固定在振动筛上，然后安装新的剃须刀片。用冰包围腔室，加入两个10毫升体积的冰块，用细胞外溶液制成，并补充六毫摩尔葡萄糖。
将切片机设置为每秒0.05至1毫米和70赫兹，然后开始切片以获得140微米厚的琼脂糖切片，表面积为20至100平方毫米。使用细油漆刷小心地将每片转移到100毫米培养皿中，培养皿中装有40毫米HEPES缓冲液，并补充了6毫摩尔葡萄糖。对于钙染料制备，将50微克细胞渗透性钙指示剂染料，7.5微升DMSO和2.5微升泊洛沙姆以及6.667毫升HBS溶解在15毫升螺旋盖管中。
使用移液器将溶液彻底混合20秒，然后将管浸入超声波浴室中并涡旋，每次30秒。然后将3.333毫升所得钙指示剂染料溶液等分试样，放入每10片组织中待标记的5毫升培养皿中。对于染料装载，使用薄的软画笔将多达10个组织切片转移到每个染料溶液皿中，并将培养皿放在轨道振荡器上，在室温下以每分钟40转的速度进行50分钟的光照保护。
在孵育结束时，将多达20个染色切片转移到充满无染料HBS的单个60毫升培养皿中。对于通过共聚焦显微镜进行的钙成像，请选择20或25倍放大倍率，并将采集模式设置为延时成像，将针孔设置为100至200微米，以及实验中使用的荧光团的激发和发射。将记录室和灌注系统安装到显微镜的温度控制载物台上，并将入口和出口放置在记录室的远端边缘。
将流入和流出速率设置为每分钟 1 到 2 毫升。将富集系统的温度设置为37摄氏度，并用非刺激性溶液启动普华。为了记录组织的钙动力学，将单个组织切片放入记录室中，并用U形铂砝码和绷紧尼龙网固定组织。
使用明场选项定位感兴趣的结构，并使用实时成像将研究的结构定位到视野中。要优化信噪比，请调整激光功率、检测器放大和线平均分档，同时保持最小的激光功率。将焦平面调整到切割表面以下15微米，以避免潜在受损细胞的记录并获取图像。
将采样频率设置为一到两赫兹，以便对单个振荡进行初始检测并记录高分辨率图像。如果可用，请使用在线图表获取有关制备响应、过度照明、光漂白和机械漂移的即时反馈。采集完所有图像后，保存数据以供以后分析。
这里可以观察到最佳组织切片的示例，其中细胞渗透性钙指示剂染料被成功加载到胰腺组织切片中。相比之下，由于染料渗透不成功，胰岛细胞缺乏或样品表面上有大量坏死组织，这些组织切片不是成像的最佳选择。胰腺组织切片的高分辨率图像可用于描绘胰腺组织的不同区域，例如朗格汉斯胰岛，腺泡组织或胰管。
刺激可用于在功能上区分不同的胰岛细胞或胰岛和非胰岛细胞。例如，β细胞通常通过表现出细胞内钙的瞬时增加，然后在持续的平台上快速钙振荡来响应方脉冲葡萄糖刺激。相比之下，非β细胞的反应更快，更不规则。
还可以测量刺激后细胞内钙发作的延迟增加，以及单个细胞之间的异质性和延迟。可以使用相同的参数来描述停用阶段。在这里，可以观察到细胞内钙振荡持续时间，频率和活动时间百分比的示意图。
当以大于10赫兹的采集速率成像时，可以清楚地识别在胰岛上反复扩散的钙波。将胆总管尽可能紧贴十二指肠，以防止意外阻塞进入胰腺的分支。另外，在注射过程中不要停止压下柱塞，因为琼脂糖会立即在针头中变硬。
急性小鼠胰腺组织切片技术也可以与膜片钳方法一起使用，以研究离子通道电流并进入细胞形成以及免疫组织化学研究和秘书研究。
