通过等密度梯度纯化对U937细胞进行细胞分级分离

该协议很重要，因为它提供了一种将四个细胞区室彼此分离的方法，即细胞质，细胞核，线粒体和膜。不仅如此，它还是一种可扩展、可重复的程序，具有可靠的结果。该技术的主要优点是分离四个细胞区室，洗涤剂的使用最少，从而实现更可重复、更可靠的分馏过程。

对于胞质蛋白分离，在RPMI 1640中用10%胎牛血清在37摄氏度和5%二氧化碳下培养U937细胞，最终总共6个乘10至第八个细胞。离心培养物，并将细胞沉淀重悬于室温PBS中至终浓度为每毫升4×10至第六个细胞，轻轻移液以分解团块。第二次离心后，将沉淀重悬于冰冷的裂解缓冲液A中，终浓度为每毫升2×10至第七个细胞。

将7.5毫升细胞加入冰上的锥形管中用于下游核蛋白提取，并通过离心沉淀剩余的细胞。将沉淀重悬于细胞质分离缓冲液中，终浓度为每毫升2×10至第七个细胞，轻轻移液以分解团块，然后将细胞在4摄氏度下孵育20分钟，并结束旋转。在孵育结束时，离心细胞悬液并将上清液转移到干净的离心管中。

离心上清液以沉淀细胞碎片。离心后，将上清液转移到新的离心管中，并重复离心序列，直到观察到无沉淀。当样品清除碎片时，将含有胞质级分的上清液在 4 摄氏度下储存长达一个月。

然后将储存的细胞沉淀重悬于裂解缓冲液A中，至终浓度为每毫升4×10至第六个细胞。对于细胞匀浆，离心细胞悬液并丢弃上清液以去除多余的洋地黄皂苷和收缩期污染物。将沉淀重悬于冰冷细胞匀浆缓冲液中，终浓度为每毫升4×10至第六个细胞，在冰上孵育30分钟。

同时，对于基于珠子的机械裂解，将30克预洗的不锈钢3.2毫米珠子加入15毫升裂解缓冲液B中，放入50毫升裙边管中的冰上冷却。在孵育结束时，用细胞悬液替换裙边管中的缓冲液，并以第八速度混合细胞五分钟。裂解后，将匀浆转移到干净的管中。

离心匀浆，然后将上清液转移到新管中。要从样品中去除任何残留的碎屑，请按照指示将匀浆离心三次，每次离心后将上清液转移到新管中。最后一次离心后，为了分离粗线粒体级分，将上清液转移到新管中进行离心。

离心后，将上清液转移到新管中，并将含线粒体级分的粗沉淀放在冰上。为了分离膜级分，离心收集的上清液，丢弃上清液后将含有粗膜级分的沉淀放在冰上。对于等密度梯度纯化，将粗线粒体和膜级分沉淀重悬于200微升裂解缓冲液B和1.8毫升碘沙醇中。

要为每个样品创建不连续的碘沙醇梯度，首先，将一毫升 15% 碘沙醇添加到每个样品一个 8 毫升开顶薄壁超速离心管的底部。接下来，在每个管中依次在15%碘沙醇层下方覆盖一毫升20%碘沙醇，一毫升25%碘沙醇，一毫升30%碘沙醇和一毫升35%碘沙醇。在一个梯度的底层下加入两毫升粗线粒体颗粒悬浮液，在第二梯度的底层下加入两毫升粗膜颗粒悬浮液。

小心地将一毫升10%碘沙醇层在每个梯度的顶部，并在通过密度梯度离心纯化线粒体和膜组分之前，根据需要添加10%碘沙醇来平衡10微克内的试管。在分离结束时，使用针刺穿薄壁管的侧面，以收集每个样品的可见条带。对于核蛋白分离，离心悬浮在裂解缓冲液A中的7.5毫升等分试样细胞，并通过移液和涡旋将沉淀重悬于800微升冰冷细胞增溶缓冲液中。

将悬浮液在冰上孵育30分钟以破坏血浆和细胞器膜，同时保护核蛋白。在孵育结束时，离心细胞悬液并通过轻轻移液到800微升冰冷的核裂解缓冲液中重新悬浮沉淀，每微升Benzonase补充一个单位。将混合物在四摄氏度的末端旋转器上孵育以破坏核膜。

30 分钟后，以 20% 的功率超声处理混合物三次，每次 5 秒，脉冲之间暂停 5 秒以剪切核酸。最后一次超声处理后，离心匀浆并收集上清液作为核级分，而不会干扰沉淀。密度梯度纯化后每个级分的蛋白质印迹显示线粒体级分定位到25%和30%碘沙醇层，膜级分定位到10%和15%碘沙醇层。

蛋白质血液分析还证实，每个分离的样品都是纯净的，不受细胞其他部分蛋白质的污染。此外，对每个样品的条带强度进行密度分析证实了数据的重现性和统计意义。分级分离执行不当会导致细胞成分交叉污染。

例如，胞质级分中高浓度的组蛋白H3可能是由于胞质级分的澄清不当造成的。等密度纯化过程中的失败会导致膜组分污染。在蛋白质免疫印迹分析之前进行蛋白质定量测定以确认馏分确实含有蛋白质以允许基于蛋白质量的凝胶上样，并确认该程序已正确执行，这可能是有用的。

至关重要的是，细胞质部分不含沉淀。可以按照此过程进行蛋白质印迹或ELISA，以允许您在特定条件下分析不同蛋白质的亚细胞位置。这项技术使我们能够分析高血糖条件下不同细胞死亡因子的运输。

因此，对我们来说，这有助于阐明从细胞凋亡到坏死的高血糖转变的机制。