初白和棕色预生细胞与新生小鼠的隔离和分化

该协议提供了一个简单的策略，以产生白色和棕色脂肪细胞的细胞培养模型，忠实地回顾体外，我们在体内的脂肪组织的生理学。该协议允许同时分离来自新生小鼠的白色和棕色预生细胞，以及我们使用这种方法分离的细胞，评估高扩散能力和分化潜力。使用这种方法分离的细胞比其他培养模型更能反映脂肪组织的复杂性。

它可以用来更准确地研究肥胖和糖尿病中的脂肪细胞功能。我们主要关注于了解肥胖症中的脂肪组织功能障碍。然而，用这种方法准备的细胞也可以用来研究发育生物学中细胞的基本问题。

成功实验的关键是确定如何确定白色脂肪库为这些库，这些仓库虽小，但非常丰富且繁殖的预生细胞在幼崽中很难区分。视觉演示说明此协议是多么简单，并允许提供查找和解剖白色和棕色脂肪库的提示。看到仓库隔离是非常有帮助的。

收集皮下白色脂肪组织，切开安乐死的新生幼崽腹部周围的皮肤，轻轻拉下腿部的皮肤。在不收集任何皮肤组织的情况下，小心地收获脂肪库，脂肪库将显示为附着在皮肤内部或四头肌顶部的透明或白色、细拉长组织。冲洗 PBS 中收获的仓库，并将脂肪组织放置在 1.5 毫升管中，其中包含 250 微升 PBS 和 200 微升 2X 隔离缓冲器。

要收集闭双面棕色脂肪组织，从肩部刀片上拉起皮肤，抬起位于肩部刀片之间的深红色棕色脂肪组织。小心地在脂肪周围切开，将其从身体分离出来，并检查组织是否一致性和颜色。冲洗后，将组织放在第二个1.5毫升管中，其中含有250微升PBS和200微升的2X隔离缓冲器。

收集完所有仓库后，使用剪刀将每个仓库直接在管内轻轻切碎四到六次，并在每个管子的 2 倍隔离缓冲中加入 50 微升 10 倍拼贴酶。然后快速倒置管子，在37摄氏度和每分钟1400转的温度控制搅拌机中混合并放置组织30分钟。在消化结束时，将管子放回冰上，通过100微米细胞过滤器过滤消化组织，进入新的50毫升管。

为了最大限度地提高细胞产量，用一毫升的隔离介质冲洗每个管子，并通过过滤器过滤洗涤。在新的隔离介质中，将棕色和白色脂肪组织溶液稀释到每口油井两毫升的组织悬浮液中。然后板两毫升的白色脂肪组织悬浮到每四到六口井和两毫升的棕色脂肪组织悬浮到每两到三口井的六井板通过一个100微米过滤器每井。

当所有细胞都镀上后，将板放在细胞培养孵化器中60至90分钟。在孵化结束时，用两毫升无血清介质清洗每口油井，轻轻搅拌板，将任何血细胞从井底分离。洗三次后，在井中加入两毫升新鲜隔离介质，并将板返回细胞培养孵化器。

当细胞达到80%至90%的结合度时，在37摄氏度的蒸馏水中涂上无菌0.1%明胶的新目标板，10分钟。当板正在孵化时，用PBS清洗细胞，然后在细胞培养孵化器中用肌素治疗三分钟。当细胞分离时，移液器将细胞悬架多次，以最大限度地提高细胞的恢复，并将细胞转移到新的管子上。

收集完所有细胞后，用一毫升的隔离介质清洗每口井，然后用细胞悬架拉洗。通过离心收集细胞，并将颗粒重新用三到五毫升的隔离介质进行计数。将细胞稀释到适当的浓度，用于在新鲜隔离介质中电镀，用 PBS 清洗明胶涂层板，以去除任何多余的明胶。

然后将细胞播种到明胶涂层板上，并将细胞返回细胞培养孵化器。当细胞达到共存时，用分化介质替换隔离介质。如果区分棕色脂肪组织前体细胞，也添加一个纳米材料三聚二甲酸酯。

48 小时后，用每个培养金适当的维护介质刷新介质。此时，细胞内小液滴的积累应在明亮的场显微镜下可见。即使在过滤后，一些细胞碎片和血细胞仍然留在细胞悬架内。

电镀一小时后轻轻洗涤会去除与此无关的细胞，因为预编细胞会迅速附着在井底。虽然从新生幼崽身上分离出的白色和棕色预生细胞具有很高的扩散能力，但每个库的白色预生细胞的产量通常是棕色预生细胞的两倍。因此，如果需要同步培养，则必须相应地计算白色预组织体的启动密度。

在分化结束时，细胞将显得充满脂质液滴，并分别表达白色和棕色脂肪细胞的经典标记。在基底条件下初级白细胞和棕色脂肪细胞的线粒体应激测试中，以及针对线粒体功能已知刺激器的对比分析中，可以观察到每个细胞类型的这种特定生物能学能力。请记住，我们正在隔离活细胞，我们希望培养它们几天。

因此，请务必在隔离期间保持无菌状态，以避免污染，这可能会损害后续的文化。这种方法产生完全成熟的脂肪细胞，可用于不同的应用，包括功能检测，基因或化学屏幕，或卵母分析，以研究细胞自主机制，影响脂肪细胞功能。