使用自动高含量分析仪进行活细胞显微镜的果蝇胚胎制备和微注射

该协议允许在一个成像会话内同时采集多个胚胎。虽然样品制备适用于使用高含量分析仪的多点采集，但使用该协议制备的样品可以在任何能够多点采集的倒置显微镜上进行成像。首先，使用鸡蛋采摘工具，在大盘子的干净部分组织两排15到20个胚胎。

将胚胎在腹侧以相同的方向与前端和后端对齐。将一个空间器粘在盖玻片上，并条纹 10 微升的六光胶下外露盖玻片玻璃内嵌。当胶水干燥时，用剃刀刀片在两排胚胎周围切割一个矩形。

在第一个矩形旁边剪切第二个矩形，并删除不锈钢铲的直边的第二个矩形。小心地将铲的直边滑到第一个矩形下并将其拆下。然后，将带胚胎的切口放在3.5厘米培养皿的外侧。

在立体显微镜下，将准备好的盖玻片放在胚胎上，轻轻将两排胚胎压在胶水上。如果不执行微注射，则用一对一卤化碳油 700 填充到顶部的硅胶垫片，以 27 至卤化碳油。用双面胶带将四滑板适配器的底部边缘对齐。

这将防止幻灯片在成像期间移动。确保不要将胶带放在客观透镜的路径中。将盖玻片安装在四滑板适配器上。

如果对胚胎进行微注射，将带胚胎的盖玻片放在滑梯上，以防止盖玻片底部在干燥和微注射过程中变脏。将胚胎干燥5至10分钟，然后立即用一对一卤化碳油700至卤化碳油27覆盖胚胎，将硅胶垫片填充到顶部的一半。使用扩展的加载尖端，用大约两微升注射剂装载两个或三个微注射针。

将针头安装到微注射器上，将柱塞压到尖端的一半，增加玻璃毛细管内部的气压。将玻璃针放到玻璃滑梯上，用新的九号剃须刀切割针头，以 45 度角切割，以产生锋利的打开尖端。注射剂应向到尖端底部，而不流出针头。

小心地在针尖上加入 20 微升卤化油，然后以 45 度角重新切割。注射剂应开始快速流动，因此请记住通过缩回柱塞来调节压力。使用微操纵器将针头定位在视场的中心。

然后提起针头，从针头下面取下玻璃滑梯。将胚胎放在立体显微镜阶段，放在微注射针下，以50倍的放大倍率聚焦在胚胎上。降低针头，直到它进入与胚胎相同的焦点平面。

用一只手移动幻灯片，用另一只手操作微注射器，注射一排胚胎。抬起针头，旋转滑梯180度，将第二排胚胎暴露在微注射针上。放下针头，注射第二排胚胎。

该协议用于检查微管在果蝇胚胎的线粒体重组中的作用。定量比较了几种微注射药物治疗对ER重组的影响。科尔奇辛，防止新的微管聚合，被发现大大减少ER到主轴极的定位在分粒。

为32个胚胎获取了时间推移成像数据。使用自定义 MATLAB 脚本从 12，800 个感兴趣的区域分析了均值和最大强度测量。首次尝试此协议时，请记住不要在任何步骤上花太长时间，否则可能会错过想要映像的发育阶段。

在尝试任何实验之前，逐步练习此协议。我们的样品制备方法有助于在一个实验中同时采集多个胚胎，从而产生足够的实验复制进行定量分析。该协议可以帮助发育胚胎学从定性到定量成像实验的过渡。

在一次成像会话中成像多个胚胎的能力也消除了复制之间的实验噪声。