量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

在秀丽隐杆线虫中使用聚谷氨酰胺荧光报告基因的组织特异性表达非常重要，因为它允许在完整的多细胞生物体的背景下发现和表征蛋白质稳态调节因子。该技术的主要优点是，它允许可视化和量化体内细胞蛋白质平衡的年龄相关下降，这对于更深入地了解生物体如何保持蛋白质组的适当折叠和功能以及衰老的影响至关重要。阐明能够保存蛋白质平衡的机制将有助于开发有针对性的干预措施，以治疗蛋白质平衡受损的衰老相关疾病，并促进健康衰老。

蛋白质稳态塌陷是一个巨大的临床问题，因为它是蛋白质错误折叠疾病发展的基础，包括阿尔茨海默氏症，帕金森氏症，亨廷顿舞蹈症和肌萎缩性侧索硬化症。首先使用直径为6厘米的培养皿为每种测试条件准备五个琼脂板。对于RNAi实验，诱导转化的HT115大肠杆菌中dsRNA的产生，并使用RNAi琼脂。

在标准NGM琼脂上使用OP50大肠杆菌进行无RNAi的实验。在37摄氏度下将大肠杆菌培养过夜，同时以220 RPM振荡。第二天，通过以2， 400 G离心15至20分钟沉淀细菌，然后吸出上清液并将沉淀重新悬浮在起始体积的十分之一lb中。

将200微升的浓缩细菌等分到每个板上，并让打开的板在干净的环境中干燥，直到所有液体都被吸收。为了使秀丽隐杆线虫与次氯酸盐处理同步，用M9缓冲液洗涤妊娠雌雄同体两次，然后将它们转移到新鲜管中，在5毫升次氯酸盐溶液中孵育5分钟，每分钟摇动一次。孵育后，将动物旋转下来，用M9缓冲液清洗三次。

让胚胎在3毫升M9溶液中在管中孵化过夜，并在20摄氏度下旋转。通过将10微升L1溶液滴到6厘米的板上三次并计数L1动物的数量来计算L1动物的密度。定期混合L1溶液以防止动物沉降。

将50 L1一只动物种到每个盘子上，计数并记录播种的数量，并将盘子移动到20摄氏度的培养箱中。或者，为了通过产卵同步动物，将五到十只年轻的，怀孕的成年动物放在每个盘子上四到六个小时，让它们产卵，直到每个盘子大约有50个卵。取出所有受肉质的成虫，并将装有卵的盘子移动到20摄氏度的孵化器中。

将动物培养到L4阶段，在20摄氏度下大约需要40个小时。然后加入50微升160倍FUDR。为了测量肌肉组织中蛋白质平衡的下降，选择20只动物并将其安装在显微镜载玻片上，其中有3%琼脂糖垫和5微升10毫摩尔叠氮化钠。

在所有蠕虫固定后，使用10 X放大镜对动物的整个身体进行成像。使用 FITC 或 YFP 滤镜，并对每只动物进行相同的曝光。完成后，丢弃幻灯片。

数一数整个动物体壁肌肉中的病灶数量。焦点是较亮的标点信号，可以与背景中较暗的可溶性信号区分开来。在得分日，用动物看盘子并记录瘫痪动物的数量，然后从盘子中取出瘫痪的动物。

实验完成后，计算每种情况的麻痹率并绘制麻痹进展图。为了测量神经元组织中蛋白质稳态的下降，如前所述将蠕虫安装在载玻片上，并使用40 X放大镜在复合显微镜上拍摄动物头部的Z堆叠图像。成像后丢弃载玻片。

获取图像后，将Z堆栈变平并使用它们来量化位于神经环区域的神经元中的病灶数量。绘制YFP病灶从第4天、第6天、第8天和第10天开始的积累进展。在成年期的第二天，从板中挑选10只同步的动物，并将它们放在显微镜载玻片上的10微升M9缓冲液上。

重复此步骤至少四次，以获得40个或更多动物的样本。使用具有视频功能的相机在体视显微镜上视频记录动物的运动30秒。录制所有要分析的动物的视频后，播放视频并对每只动物的身体弯曲进行评分。

在柱形图中绘制每只动物的身体弯曲次数，其中每个点表示 Y 轴上 30 秒内的身体弯曲次数，以及在 X 轴上测试的不同条件。聚戊胺重复模型有助于鉴定调节蛋白质静膜网络的基因。肌肉特异性polyQ-YFP表达导致荧光病灶的积累，这些荧光病灶在简单的荧光解剖显微镜下易于定量。

动物在中年时会瘫痪，因为肌肉内的蛋白质组由于报告者的蛋白质毒性作用而崩溃。与年龄相关的神经元蛋白平衡下降之后，可以直接量化将动物放入液体后聚集体形成和协调身体弯曲的下降。该方法已用于表明同源结构域相互作用蛋白激酶（一种转录辅因子）通过调节自噬和分子伴侣的表达来影响衰老过程中的蛋白质稳态。

HPK-1的损失增加了在老化过程中积累的Q35-YFP聚集体的数量。对照动物平均显示18个聚集体，而HPK1空突变体和HPK1 RNAi处理动物平均分别显示28个和26个聚集体。到成年期的第八天，77%至78%的HPK1缺陷动物瘫痪，而对照组只有50%。

此外，HPK1的过表达被证明可以调节蛋白质聚集体的形成，并保护衰老的动物在衰老过程中免受Q35-YFP相关的瘫痪。该方法测量细胞类型内蛋白质组的一般下降。存在许多方法来评估前列腺网络特定组件的变化。

它们共同提供了一幅全面的画面。蛋白质平衡下降是衰老的标志。这种方法使研究人员能够量化这种下降。

当与基因分析相结合时，它是发现的强大工具。