用细胞内快速光化学氧化蛋白质对细胞内蛋白质进行特征化

细胞内FPOP与质谱法相结合是一种强大的新技术，用于研究活细胞中的蛋白质相互作用和蛋白质结构变化。使用细胞内FPOP，您不需要分离感兴趣的蛋白质，而是可以在它们的原生环境中研究它们。这对膜蛋白特别有帮助。

通过这种方法，您可以研究各种疾病（包括癌症和遗传性疾病）中结构和蛋白质相互作用的变化，以便更好地了解和描述它们。要开始装配流系统，请使用裂石将熔融石英管切割到适当的尺寸。接下来，将六块小圆柱形磁铁放在一个 500 微升注射器中，然后填充注射器、第二个 500 微升注射器和两个带护套缓冲液的 5 毫升注射器。

除气后，将注射器放在注射器泵上，并拧紧注射器泵塞，使当电机失速时，细胞注射器还剩下大约 50 微升。使用引诱适配器，将手动阀连接到每个注射器，并如图所示组装二氧化硅管，确保将电池加上过氧化氢硅管线穿过十字架，并将其直接插入 450 ID 二氧化硅管管。连接所有管材后，将流系统放在激光器旁边，并使用打火机烧掉 450 微米内径管上的二氧化硅涂层，以制作激光照射窗口。

将磁力搅拌器放在包含六块磁铁的细胞注射器上方，将注射器泵设置为每分钟 492.4 微升，最终流量为每分钟 1083.3 微升。流缓冲器通过系统三次冲洗系统，检查每个连接是否有任何泄漏。使用凸透镜将兴奋激光聚焦到二氧化硅管上。

要测试辐照窗口，请将一小张纸放在硅胶管后面，然后打开激光。然后，测量从辐照中燃烧的区域，并使用辐照窗口和流速计算所需的激光频率，以获得零的排除分数。要收集手术的细胞，用适当的细胞培养等级盐溶液清洗细胞，从70%至90%的汇合T175烧瓶培养液中清洗。

将细胞重新在10毫升缓冲液中，用于计数和通过离心收集细胞。对细胞进行计数以确保它们足以进行下游分析至关重要，但不会太多细胞来聚合和堵塞流系统。然后每毫升护套缓冲液浓度的2倍10至6个细胞重新填充细胞，将细胞分成每样本500微升体积。

对于细胞内FPOP，用新鲜护套缓冲液填充两个五毫升注射器，用一个等分细胞填充含有磁铁的500微升注射器，用新鲜准备的200毫升过氧化氢填充最后500微升注射器。打开磁力搅拌器，将二甲基硫化物的220微升中的峰值打开，将二甲基硫化物的尖峰打开，将二甲基硫化物的尖峰变成一个昆奇的一个分量。轻轻混合后，将 Quench 放在流系统后面，收集辐照样品并打开激光。

七秒钟后，打开流量系统。样品完成流动后，关闭激光，将 Quench 与采集的样品轻轻混合。接下来，用新鲜缓冲液填充所有四个注射器，并通过流系统冲洗缓冲液。

系统完成冲洗后，使用新的等同细胞和溶液重复该过程，无需照射，作为无激光控制，以考虑细胞内的背景氧化。当下一个样品运行时，将第一个样品离心机，将颗粒重新在100微升的适当细胞解解缓冲液中。然后，将样品转移到微离心管中，在液氮中闪冻。

当所有样品都运行完后，拆解流系统并丢弃用过的二氧化硅管。然后，在 50% 水 50% 甲醇溶液中通过声波清洁所有其他连接一小时。根据标准协议从细胞中分解和消化蛋白质后，根据标准串联LCMS协议分析消化的细胞酸盐，使全细胞的FPOP修饰蛋白本地化。

然后，将数据加载到适当的蛋白质分析软件程序中，根据相关的蛋白质数据库和相关消化酶分析数据。一旦文件完成搜索，计算FPOP氧化对感兴趣的蛋白质的程度。正交YZ堆叠图像的荧光成像显示，当护套缓冲液流过激光照射窗口时，护套缓冲液与细胞溶液的分离清晰。

可以生成护套缓冲液或细胞溶液的三维平均热图，以说明两种溶液的最小混合。使用单细胞流动系统可使氧化修饰蛋白的数量增加13倍。为了确认在完整细胞内感兴趣的蛋白质的修饰，荧光成像可以在过氧化氢处理和辐照后进行。

使用串联质谱法，这些修饰可以进一步本地化到蛋白质上的特定氨基酸。在此提取的离子色谱中观察到的变化转化为改性肽中氧化的海氨酸引起的疏水性变化。通过体外足迹比较细胞内标记的行为素，可以发现类似的氧化水平，表明行为素在细胞内和体外研究中具有类似的溶剂可访问性。

此外，比较了对兴趣蛋白快速光化学氧化程度对溶剂的可访问性进行修改，从两种作用素晶体结构中计算出的标签残留物表明，在细胞内快速光化学氧化的感兴趣的蛋白质有效地探寻了单体蛋白的溶剂可访问性。有几个额外的步骤，可以采取，以增加检测较低的丰富的FPOP修改，包括2D色谱，亚细胞分馏和蛋白质组复用技术。使用细胞内FPOP，我们现在可以进行蛋白质结构生物学，以更好地连接蛋白质结构与细胞功能。

由于 FPOP 需要 248 纳米波长，请务必始终佩戴紫外线防护护目镜和合适的衣物，以避免意外暴露于反射或分散的辐射中。