细菌细胞的三维成像，实现精确的细胞表现和精确的蛋白质定位

因为细菌这么小，人们常常忘记它们是三维物体。我们的协议允许对扁平和弯曲细胞的形状进行精确重建。该协议只需要对标准显微镜稍作修改，并且可在 MATLAB 脚本中随时提供。

在开始实验之前，在单个玻璃显微镜幻灯片的两端放置三个 20 到 20 毫米盖滑的两叠。将 200 微升的 agarose 垫溶液移到幻灯片上，并立即牢牢地将第二个幻灯片放在盖滑堆上，以压平加糖。在允许气糖在室温下凝固约一分钟后，小心地从顶部滑梯上滑下来，并使用 200 微升移液器尖端的大端从凝胶中切出单独的 5 毫米直径垫。

当所有垫片都获得移液器时，大肠杆菌细胞培养剂会多次破坏任何细胞团，并确保细胞均匀分布，然后再在每个垫片上添加一微升亚培养素。让样品风干 5 到 10 分钟后，确认液滴已完全吸收到垫片中，然后再将盖滑到垫上。然后使用棉签轻轻刷适当的密封剂周围的盖滑的边缘，注意保持密封剂远离盖滑的顶部。

密封盖滑后，立即将幻灯片置于显微镜阶段，并在五分钟的热平衡后使用显微镜对焦轮将细胞中间对焦。在 ND 采集下关联的显微镜软件中，选中 Z 框以获取 Z 堆栈，然后单击"主页"按钮将单元格的中间设置为起点。将步长设置为 0.1 微米，将范围设置为 4 微米，并确保 Z 设备设置为压电级。

细胞的顶部和底部都有足够的模糊，使细胞与背景几乎无法区分，这一点至关重要。将 lambda 窗口下的荧光通道设置为要成像的荧光分子的设置，并确认实验顺序设置为 lambda，以便在切换之前在每个颜色通道中获取完整的 Z 堆栈。然后单击"立即运行"以开始图像采集。

获得所有图像后，打开相应的图像分析软件程序中的文件。在单个单元格周围绘制一个框，并复制该单元格两次，每个通道复制一次，确保选中"重复"堆栈框，然后将通道更改为一个或两个。两个堆栈可用后，选择"图像"、"堆栈"、"工具和串联"以组合图像。

用蛋白质通道第一，形状通道第二。将新映像保存为 TIFF 文件后，在桌面上的文件夹中创建一个文件夹，其中包含裁剪的图像和cell_shape_settings_tri。txt 文件从 shae 细胞组织 - 公共exampleData_tri。

编辑cell_shape_settings_tri。txt 文件具有感兴趣的实验的正确设置。然后运行Cell_shape_detector3dConvTriFolder，将字符串与文件夹位置的函数一起运行，然后返回要启动的单元格数和应运行的单元格数。

确认单元格已正确重建运行 ScreenFits。当图形用户界面打开时，单击"选择文件夹"按钮并选择包含重建数据文件的文件夹，以直观地筛选单个单元格重建。对于出现误报或缺少全覆盖的任何单元格，请选择重建旁边的框，以附加名称的附属标志，以便可以从任何下游分析中排除。

运行富集平滑孢子线，以创建相关蛋白质的相对浓度的富集图，作为表面高斯曲率的功能。然后选择每个文件夹与刚刚创建的 TRI。垫文件，并选择新创建的曲线垫文件。

当处理弯曲或异常形状的单元格时，此方法特别有用，因为 2D 表示无法准确反映细胞的曲率。在实验中，生成了一种绿色荧光融合蛋白，以产生细菌作用素蛋白 MreB，以研究野生细胞和突变大肠杆菌细胞中作用素蛋白的精确定位。通过进行3D测量，可以捕获野生类型和棒子突变细胞的形状。

然后，MreB 的定位被确定为以小高斯曲率进行丰富，这种几何特征只能以 3D 方式以 rodZ 相关方式测量。请记住，确保 Z 堆栈足够大，使单元格在顶部和底部模糊不清，并且单元格彼此之间彼此之间空间良好。我们正在展示如何测量3D中蛋白质的几何定位，但可以从这些数据中计算出其他信息，例如标签蛋白组件的大小。