纤维细胞衍生的三维矩阵系统适用于内皮管形成测定

该协议可以查看不同类型的区域性并观察它们与细胞外矩阵的相互作用。此方法的主要优点是，您获得的基质由成纤维细胞再生，并且与体内生成的基质非常相似。我们认为，这种疾病在使用从烘焙菜肴获得的成纤维细胞时是无关紧要的。

从这些细胞建立一个矩阵可以启发我们如何能影响，例如，持续的情况。这些方法也可以应用于，例如，从矩阵礼节对幸存者进行物理研究。此协议的可视化对于观察必须执行的步骤的移液技术非常重要。

首次尝试这些方法时，可能需要比预期更多的时间。我们的建议是，您可以提前做好准备，并使用持续时间为下一步做准备。首先根据手稿说明制备0.2%明胶、1%谷胱甘肽和一个摩尔乙醇胺溶液。

在使用前，请确保通过 0.22 微米过滤器运行每个解决方案。接下来，准备抗坏血酸和解液缓冲液。稀释手稿中描述的 PBS 笔链，用 10% FBS 准备 DMEM。

在100毫升无菌水中加入2克BSA，并在沸水浴中加热7分钟，准备热变性2%BSA。然后，补充FBS青霉素，链霉素，根霉素，和安博他林B.培养重组端粒转染不朽的人类外白皮肤成纤维细胞和DMEM与10%FBS，并维持在37摄氏度和5%二氧化碳。要建立原发性成纤维细胞培养，将组织样本切成大约两到三毫升的小块，并在高浓度抗生素的 FPS 中播种。

当出现第一个成纤维细胞时，用 FBM 介质更换介质以进行细胞维护。在六井板的每个井中加入两毫升0.2%明胶溶液，在4摄氏度下孵育一小时，温度为37摄氏度或过夜。孵育后，吸明胶，用两毫升PBS清洗每井。

在每个井中加入两毫升1%的谷胱甘肽，并在室温下孵育板30分钟，将明胶交上交。吸进谷胱甘肽，用两毫升PBS清洗水井五分钟。要阻止剩余的谷胱甘肽，加入两毫升一种摩尔乙醇胺，并在室温下孵育板30分钟。

吸气乙醇胺，用PBS重复洗涤。加入10%FPS的一毫升DMEM。如果介质立即变成粉红色，将其取出，用两毫升 PBS 洗涤一次，再添加一毫升 DMEM。

种子一毫升的成纤维细胞悬浮液与5 x 10到第五细胞在每个井和培养细胞，直到100%汇合达到。然后取出介质，用10%FBS和每毫升50微克的抗坏血酸代替DMEM。每两天更换一次介质六天。

上次抗坏血酸治疗两天后，取出介质，用两毫升 PBS 清洗水井。洗涤后，慢慢加入一毫升预热裂解缓冲液，在室温下孵育板5至10分钟，直到裂解成纤维细胞。在不去除解液缓冲液的情况下，小心地将两毫升 PBS 添加到每个井中，然后吸气约 2.5 毫升。

重复此过程两次，总共洗三次。最后洗涤后，加入两毫升PBS与笔链。用薄膜密封盘子，并在四摄氏度下保持长达三个月。

用2%FBS生长HUVEC细胞和 EMB-2，直到最大汇合。然后用没有 FBS 的 EBM-2 更换介质 8 小时。要准备细胞种子的基质，请将其从冰箱中取出，并在室温下保留一小时。

通过加入两毫升热变性 2%BSA 来阻断基质，并在 37 摄氏度下孵育一小时。然后，吸气 BSA，用两毫升 PBS 清洗。种子2 x 10至第五HUVEC细胞到板的每个井涂上成纤维细胞衍生基质。

在37摄氏度下孵育细胞16小时，然后在标准明亮的磁场显微镜下以20-40倍的放大倍率检查管状结构。该协议用于研究PDGF治疗对成纤维细胞衍生基质形成的影响。与没有PDGF的细胞，用PDGF孵育的BGH第三成纤维细胞在基质中表现出更一致的细胞分布。

胶原蛋白1和纤维素蛋白表达在从PDGF刺激成纤维细胞中提取的基质中增加，因此基质厚度增加。此外，定向直方图表明胶原蛋白1和纤维素显示平行模式。当HUVEC细胞被播种到从PDGF刺激的成纤维细胞中衍生出的去细胞化基质时，它们比在没有任何刺激条件下发展出更多的毛细管状结构。

确认从PDGF-BB刺激成纤维细胞中提取的基质促进内皮细胞活化。执行此过程时，请务必提前准备解决方案，并确保单元格在开始之前准备就绪。此外，内皮细胞研究基质也可以与上皮细胞播种，并观察到对外部因素的反应，如在介质或细胞毒性药物的条件。

细胞外基质的生成是肿瘤宏观环境实验设计的关键。