使用噬菌体显示肽库筛选和识别针对纤维细胞生长因子受体2的小肽

与其他方法相比，在不知道水稀释结构和目标蛋白的形成的情况下，在定量和质量上更容易发现新的拮抗剂、激动剂和同性调节器。该协议效率高、易于处理、经济实惠且具有商业性。将这种高通量筛选方法与 ITC 分析相结合，可定量、定性地获得功能小肽。

演示程序将是赵颖和王强，我们实验室的研究生。要开始此过程，请以每毫升 10 微克的浓度在涂层缓冲液中准备 FGFR2 溶液。将溶液的一毫升加入 35 平方厘米的盘子中，反复旋转，直到表面完全湿润。

在四摄氏度下孵育过夜，摇晃。第二天，倒掉涂层溶液，加入准备好的阻解溶液。在四摄氏度下孵育至少一小时，然后丢弃阻塞溶液，用TBST快速洗盘子六次，同时确保盘子不会干涸。

在一毫升的TBST中重建原始噬菌板库，并将其添加到涂层盘中。在室温下轻轻摇动摇床板两小时。在此之后，丢弃上经剂，用TBST洗10次。

将一毫升0.2摩尔甘油HCL加入盘中，在室温下轻轻摇动10分钟，使装订的噬菌蛋白斑。将洗入消毒的微离心管中，并在 pH 9.1 下用 100 微升一摩尔 Tris-HCL 将其中和。首先，在使用前至少一小时，在37摄氏度下预热准备好的LB和IPTG X-Gal板。

使用带滤芯的移液器尖端，在 LB 中准备 100 微升十倍稀释的 Eluent。在准备好的大肠杆菌培养达到中原阶段后，将培养的200微升分液放入消毒的微离出管中，每次洗出一个洗出的稀释液。要启动感染，在含有大肠杆菌培养的管子中加入每次稀释的50微升。涡流快速孵化，在室温下孵育五分钟。

然后使用涂层棒将 LB 和 IPTG X-GAL 板涂覆为 90 微升的混合物。五分钟后，将盘子倒置，在37摄氏度下孵育。当斑块出现时，计算斑块数数。

首先，在250毫升的埃伦迈尔烧瓶中稀释20毫升LB的隔夜培养。加入未增塑的伊卢，在37摄氏度下孵育，剧烈摇晃4-1~2小时。接下来，在12，000倍G和4摄氏度的离心，10分钟。

将上一液转移到新鲜管中。使用相同条件再次离心并丢弃颗粒。将上半液的上部80%转移到新鲜管中，并加入20%聚乙烯二醇和2.5摩尔氯化钠的1/6体积。

让噬菌菌在摄氏四度下过夜。第二天，将沉淀的噬菌（金）在12，000倍和4摄氏度的温度下离心15分钟。使用相同的条件再次丢弃上一代和离心机。

使用移液器去除残留的上流液。将颗粒重新在一毫升 TBS 中，将上一液转移到微离心管中。在12，000倍G和4摄氏度的离心机5分钟。

将上流液转移到新鲜的微离心管中，再加入1/6体积的20%聚乙二醇和2.5摩尔氯化钠，再次沉淀。在冰上孵育15至60分钟。接下来，在12，000倍的G和4摄氏度的离心机10分钟。

使用相同的条件再次丢弃上一代和离心机。使用移液器去除残留的上流液。将颗粒重新在 200 微升 TBS 和离心机中再多一分钟，以去除杂质。

然后将上流液转移到新鲜的微离心管中，以获得放大的吸水器。在这项研究中，噬菌蛋白的数量保持不变，而FGFR2蛋白的涂层浓度逐渐减少。噬菌体滴度结果表明，恢复的噬菌体数量逐渐增加，三轮后，与第一轮相比增加了65倍。

然后进行 ITC 实验，以测量小肽与 FGFR2 的亲和力。结果表明，SP1肽对FGFR2具有很高的亲和力。此数据证明了筛选协议的效率。

为了研究SP1肽的生物活性，使用CCK-8试剂盒进行成纤维细胞增殖测定。BALB/C3T3与SP1肽在不同浓度下孵育。结果表明，SP1肽抑制细胞的生长。

这里必须避免野生型噬菌体的污染。确保使用防气溶胶移液器尖端。而通过获得噬菌的扩增而生长。

此过程还可用于筛选与碳水化合物、培养细胞和组织结合的小肽。这些肽可以进一步放大诊断和靶向