基于原生自荧光的sFLIM测量植物部分荧光探针和木质素之间的相互作用

在木纤维素生物量中，分析多糖的酶活性受到与木质素非特异性相互作用的存在限制。FRET 分析是纳米尺度进化的相关方法。根据生物量的不同，获得所有部分后可能是一项挑战。

花些时间用显微切子进行分段，并进行温和的洗涤。对荧光寿命和光谱测量进行整理，可以对木质素和TAG分子进行定量敏感和明确的FF前测定。此方法使用棘手的技术，如多维显微镜采集和分析的样本剖面，通过可视化演示可以很容易学习。

从木材、小麦、纤维或碎片中准备植物样品，请使用剃须刀刀片切割一厘米长的样品，而不会损坏材料的结构，并将样品放在真空下以去除任何空气。连续24小时将PEG样品淹没24小时，50%浓度PEG在室温下在水中通过轻轻搅拌稀释。接着24小时淹没在70摄氏度的PEG100%浓度中。

100%PEG浸入后，将样品放在70摄氏度的加热板上，以5摄氏度的增量逐渐降低板温，直到板达到室温。当样品冷却后，使用微原子和一次性叶片仔细从每个PEG块获得30至60微米厚的平坦部分。用三个五分钟温和的水洗从部分取出PEG。

最后一次洗涤后，每管孵育多达三个部分，用500微升新鲜准备的荧光探针，保护72小时免受光线。在染色孵化结束时，使用刷子将部分转移到幻灯片上，然后安装玻璃滑梯和数字 1.5H 盖滑之间的部分。要确定 sFLIM 探测器的光谱窗口宽度，请将尿素晶体放在玻璃底部为 0.17 微米的培养盒中，然后将该盒放在显微镜样品支架上。

选择 20 倍目标以及具有 900 纳米波长和 2% 功率的钛掺杂蓝宝石激光器并打开扫描。要执行 sFLIM 测量，请将系统切换到 sFLIM 模式。要收集 sFLIM 探测器上的第二个谐波信号，请逐渐将激光激发波长从 900 纳米调整到 980 纳米，直到在第二光谱通道中收集第二个谐波信号。

然后确定光谱窗口长度。切换到非D扫描模式，将荧光光子发送到sFLIM探测器。将 sFLIM 采集设置为启用模式，以允许光子在单个光子计数器上计数。

当仪器准备就绪时，在显微镜舞台上的滑梯和盖板滑之间单独放置一个控制原生麦草，并设置系统到连续模式，以便进行激光扫描。设置 30 秒时间收集，并检查常数鉴别器在 1 倍 10 到 4 之间，1 倍 10 到 6 之间。然后选择样品上的测量区域，然后单击"开始"。

在测量结束时，保存 sdt 文件，并重复测量至少九个样本。必须在为光子获得足够的光子收集光子，同时避免脉冲买起来和光诱导效应，可以改变荧光寿命之间的平衡。顶部分析获取的 sFLIM 数据，将本地麦草单独数据文件导入单个光子计数器软件，并打开选项和模式，选择不完整的多指数 12.5 纳秒。

在"选项和首选项"下，选择"自动计算仪器响应"，然后选择"指数拟合模型"。对于每个通道，应用拟合模型，将拟合参数保存到电子表格中。为了比较通道和实验，计算电子表格中的主要荧光寿命。

要计算所有通道中至少 10 个样本的均值，请分析供方通道上的主荧光寿命，以确定选择最高光子数并对应于木质素最大排放量的专用通道值。要比较对照的本地麦草样本和实验样品之间的 sFLIM 和 EFRET 值，请考虑与对照组与要分析的实验样本之间的同质寿命减少相关的正 EFRET 值作为 FRET 事件进行分析。在此代表性实验中，sFLIM 曲线显示了参考样本和两个交互情况之间可以实现的一些修改。

事实上，与罗达明发射范围对应的光谱区域的荧光增加很容易可视化。仔细观察三条第一通道光子衰变曲线，也揭示了与标有罗达明的Dextrin标记的本地麦草的拐点，而不是用PEG标记的罗达明的PEG孵育的本地麦草的拐点。在拟合光子衰减曲线并计算每个通道主荧光寿命时间后，FRET特征变得更加明显。

例如，虽然荧光寿命时间会沿着本地小麦稻草样品的荧光谱增加和减少，但两个用PEG标记的PEG和带罗胺样品的Dextrin标记的德克斯特林的本地麦草段都观察到明显的FRF组织特征。在钙纤维生物质水解的背景下，该方法可以很容易地转移到各种生物量样品中的酶相互作用研究，要求对每种新生物量进行严格的表征。由于sFLIM不需要固定样品，它为动态酶木质素相互作用研究铺平了道路，并可能指导酶工程策略和生物量预处理。

与大多数时间一样，寿命测量需要使用脉冲红外激光源。必须相应地采取适当的安全防范措施。