在这段视频中，我们描述了一个模型研究，利用大鼠脑线粒体作为体外生物模型，在膜水平上淀粉样毒性的机理。尽管累积报告描述了淀粉样蛋白聚合在磷脂模型系统中的膜扰动机制，但直接针对从开发生物膜开始的事件进行了研究。在目前的视频中，我们描述α-核素的淀粉样纤维分析大鼠脑线粒体膜作为体外生物模型。
我们认为，线粒体作为具有良好特征的膜的细胞器，可以为与神经退行性疾病相关的膜水平上淀粉样细胞毒性机制的分子研究提供极其有用的生物模型系统。用小动物断头台斩首大鼠，并在斩首后一分钟内将大脑从规模上除名，以限制线粒体特性的可能恶化。重要的是要快速工作，并保持一切冰上在整个程序。
用30毫升的隔离缓冲液清洗组织两次。转移到含有冷隔离缓冲液的烧杯中，用剪刀细细切碎大脑。将组织悬浮液转移到20毫升冷均匀均质器。
使用九次上下冲程与电动害虫使组织碎片均匀。将混合物留在冰上约30秒后，每组三个均质冲程，以确保均质保持寒冷。将均质转移到预冷却的离心管中，在四摄氏度时以1，300 G的离心机进行三分钟。
小心地将上一液式液 dec，然后转移到预冷却的离心管中。在4摄氏度时以21，000G离心10分钟。丢弃上流剂，用移液器轻轻搅拌混合物，在密度梯度介质中重新填充颗粒。
在4摄氏度的固定角度转子中，在30，700G下离心5分钟。使用巴斯德移液器，去除顶部积聚的尖锐末端，其中大多含有米林。在线粒体分数中加入八毫升隔离缓冲液，同时用移液器轻轻搅拌混合物。
在 4 摄氏度时在 16，700 G 下离心 10 分钟。小心地拆下上清液，使底部松动的颗粒不受干扰。将每毫升10毫克无脂肪酸BSA加入离心管，同时用移液器的尖端轻轻搅拌混合物。
通过添加隔离缓冲区将体积调整为 5 毫升。在 4 摄氏度时以 6，900 G 离心 10 分钟。这应该会产生一个坚定的颗粒。
去干上经，轻轻在隔离缓冲液中重新填充线粒。用冷隔离缓冲液稀释线粒体同质质至每毫升1毫克，并放在两个1.5毫升管中，通常每管195微升线粒体。将五微升20%体积每体积Triton X-100添加到一个管中，作为最大酶活性的正对照，将5微升去压水添加到另一个管中进行控制，然后与搅拌器混合。
在设置为 30 摄氏度的温水浴中孵育管子 10 分钟。在16000G四摄氏度的固定角度转子中，通过固定角转子的管离心来降粒线粒体15分钟。使用下一部分描述的标准分光光度测定法，仔细收集产生的超生物质，以评估线粒体麦芽酸脱氢酶的活性。
计算线粒体膜的完整性如下。用于麦芽酸脱氢酶活性测定，移液器890和880微升50毫摩尔三叶草-HCL缓冲液分别对空白和样品测试库维特，其次是100微升50毫摩尔氧化乙酸酯和10微升10毫摩尔β-NADH。将铜光计放入分光光度计中，并参考空白。
加入10微升线粒体同质每毫升1毫克的样品。立即通过反转混合。在 340 纳米下，NADH 氧化导致的吸光率下降记录一分钟。
对于α-核素淀粉样颤动，添加294微升的蛋白质溶液，200微摩尔到每1.5毫升管。然后添加六微升 ThT 溶液一毫摩尔。在800 RPM的恒搅拌下，在37摄氏度的热混合器中混合溶液并孵育管。
对于牛胰岛素淀粉样纤维颤动，加入637微升的蛋白质溶液，250微摩尔到1.5毫升管。然后加入13微升ThT溶液一毫摩尔，然后搅拌。在透明底部 96 井板的每个井中加入 200 微升的蛋白质溶液。
用水晶般清晰的密封胶带密封板。将板装入 Cyation 5 荧光板读卡器。以 30 分钟间隔测量 ThT 荧光 12 小时。
在440纳米时使用激发，在485纳米时使用发射。选择井。每次测量前摇动板五秒钟。
将温度设置为 57 摄氏度，无搅拌。准备两个系列1.5毫升管含有线粒体同质酸盐，一个系列用于MDH释放测定，另一个用于线粒体ROS测量。将α-核素、牛胰岛素或母鸡蛋清裂酶的新鲜或淀粉样纤维加入线粒体同质质，然后轻轻移液。
在温水浴中，含有线粒体悬浮液的孵育管30分钟，设置为30摄氏度。对于麦芽酸脱氢酶释放测定，离心机在16，000G下孵育线粒体异质体15分钟。仔细收集产生的超级钠，以测定线粒体MDH的活性，如协议第四节所述。
计算 MDH 的释放，如下所示。对于线粒体ROS测量，移液器191微升孵育线粒体均质到96井板的每个井。添加四微升 50 微摩尔 DCFDA。
然后添加5微升200毫摩尔成功。在温水浴中孵育板30分钟，设置为30摄氏度，同时轻轻搅拌。将板装入 Cyation 5 荧光板读卡器，根据协议部分测量荧光强度。
通过测量三元 X-100 在膜中断和酶释放之前和之后，通过测量分离线粒体的 MDH 活性，评估线粒体膜完整性。如你所看到的，我们通常发现线粒体制剂是大约93%的完好无损。进行了荧光测定，以监测淀粉样纤维的生长。
三种蛋白质的淀粉样蛋白颤动曲线显示了典型的西格莫德模式，分别到达约96、12和96小时的高原，分别用于α-核素、牛胰岛素和母鸡蛋清裂酶，这表明淀粉样蛋白纤维的形成得到了AFM测量的更证实。通过线粒体MDH和线粒体ROS测量的释放，对线粒体纤维对线粒体膜的可能渗透和损伤进行了调查。正如你在左图中看到的，在线粒体中加入α-核素淀粉样纤维后观察到MDH的实质性释放。
虽然胰岛素纤维检测到轻微的释放，但母鸡蛋清裂酶纤维被发现无效。右图显示淀粉样纤维对线粒体ROS含量的影响。虽然在添加母鸡蛋清糖酶或胰岛素淀粉样纤维纤维后，线粒体ROS没有显著增强，但使用α-核素纤维素治疗导致脑线粒体的ROS含量显著增加。
本视频介绍了膜水平纤维聚集细胞毒性机制的模型研究，演示了由各种蛋白质产生的淀粉样纤维如何引起不同程度的膜损伤和渗透。虽然淀粉样纤维及其特定的结合膜的一些主题似乎提供了与膜相互作用的能力，并导致破坏稳定和随后的扰动。在这段视频之后，您将能够研究不同肽的原生形式、纤维前和成熟淀粉样纤维的相互作用，以及从不同组织或大脑不同区域分离的线粒体。
