In questo video, descriviamo uno studio modello per il meccanismo della tossicità amiloide a livello di membrana usando i mitocondri cerebrali del ratto come modello biologico in vitro. Nonostante accumuli un rapporto che descrive il meccanismo delle perturbazioni della membrana per aggregato amiloide in sistemi modello fosfolipidi studiati direttamente mirati agli eventi che iniziano a sviluppare membrana biologica. Nel presente video, descriviamo fibrille amiloide di alfa-sinuleina analizzando la membrana mitocondriale cerebrale del ratto come un modello biologico in vitro.
Crediamo che i mitocondri come organelli con membrane ben caratterizzate possano fornire un sistema di modelli biologici estremamente utile per studi molecolari relativi al meccanismo della citotossicità amiloide a livello di membrana relativa alle malattie neurodegenerative. Decapitare il topo con una piccola ghigliottina animale e rimuovere il cervello dalla scala entro un minuto dalla decapitazione del ratto per limitare il possibile deterioramento delle proprietà mitocondriali. È importante lavorare rapidamente e mantenere tutto sul ghiaccio durante tutta la procedura.
Lavare il tessuto due volte con 30 millilitri di tampone di isolamento. Trasferire in un becher contenente tampone di isolamento freddo e tritare finemente il cervello con le forbici. Trasferire la sospensione del tessuto in un omogeneizzatore a dounce freddo da 20 millilitri.
Omogeneizzare i pezzi di tessuto usando nove tratti su e giù con un pestello motorizzato. Lasciare la miscela sul ghiaccio per circa 30 secondi dopo ogni set di tre colpi di omogeneizzazione per assicurarsi che l'omogeneato rimanga freddo. Trasferire l'omogeneato in un tubo di centrifuga pre-refrigerato e centrifugare a 1.300 G a quattro centigradi per tre minuti.
Decantare con cura il supernatante e trasferirlo in un tubo di centrifuga pre-refrigerato. Centrifuga a 21.000 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un mezzo gradiente di densità mescolando delicatamente la miscela con la pipetta.
Centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 30.700 G a quattro centigradi per cinque minuti. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere l'estremità affilata del materiale accumulato nella parte superiore, che per lo più contiene mielina. Aggiungere otto tamponi di isolamento millilitro alla frazione mitocondriale mescolando delicatamente la miscela con la pipetta.
Centrifuga a 16.700 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Rimuovere con cura il supernatante, lasciando il pellet sciolto inferiore indisturbato. Aggiungere un millilitro 10 milligrammo per BSA privo di acidi grassi millilitro al tubo di centrifuga mentre si mescola delicatamente la miscela con la punta della pipetta.
Impostare il volume a cinque millilitri aggiungendo il buffer di isolamento. Centrifuga a 6.900 G a quattro Centigradi per 10 minuti. Questo dovrebbe produrre un pellet solido.
Decantare il supernatante e rimescolare delicatamente il pellet mitocondriale in tampone di isolamento. Diluire l'omogeneato mitocondriale a un milligrammo per millilitro con tampone di isolamento a freddo e posizionare in due tubi da 1,5 millilitri, tipicamente 195 microlitri di mitocondri per tubo. Aggiungere cinque microliter 20% volume per volume Triton X-100 a un tubo come controllo positivo per la massima attività enzimatica e cinque microliter acqua deionizzata ad un altro tubo per il controllo, seguito dalla miscelazione con un agitatore.
Incubare i tubi per 10 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 centigradi. Mitocondri a pellet per centrifugazione di tubi in un rotore ad angolo fisso a 16.000 G quattro centigradi per 15 minuti. Raccogliere con cura i supernatanti risultanti per valutare l'attività della malato mitocondriale deidrogenasi utilizzando un saggio spettrofotometrico standard descritto nella parte successiva.
Calcolare l'integrità della membrana mitocondriale come segue. Per la determinazione dell'attività della deidrogenasi malato, pipetta 890 e 880 microliter 50 millimolare tampone Tris-HCL rispettivamente a cuvette vuote e campione seguite da 100 microlitri 50 millimolare ossaloacetato e 10 microlitri di beta-NADH millimolare. Mettere le cuvette in uno spettrofotometro e fare riferimento a vuoto.
Aggiungere 10 microlitri mitocondriali omogeneati di un milligrammo per millilitro per assaggiare la cuvetta. Mescolare immediatamente per inversione. Diminuzione record dell'assorbanza dovuta all'ossidazione del NADH a 340 nanometri per un minuto.
Per la fibrillazione amiloide alfa-sinucleina, aggiungere 294 microlitri di soluzione proteica, 200 micromolari a ciascun tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere sei microlitri ThT soluzione un millimolare. Mescolare le soluzioni e incubare i tubi in un termomixer a 37 centigradi sotto agitazione costante a 800 giri/min.
Per la fibrillazione amiloide dell'insulina bovina, aggiungere 637 microlitri di soluzione proteica, da 250 micromolari a 1,5 millilitri tubo. Quindi aggiungere 13 microlitri Soluzione ThT un millimolare seguito da agitazione. Aggiungere aliquote 200 microliter di soluzioni proteiche ad ogni pozzo di una piastra chiara inferiore di 96 pozzetti.
Sigillare la piastra con nastro adesivo cristallino. Caricare la piastra nel lettore di lastre di fluorescenza Cytation 5. Misurare la fluorescenza ThT a intervalli di 30 minuti per 12 ore.
Utilizzare l'eccitazione a 440 nanometri e l'emissione a 485 nanometri. Selezionare i pozzi. Agitare la piastra per cinque secondi prima di ogni misurazione.
Impostare la temperatura a 57 Centigradi senza agitazione. Preparare due serie di tubi da 1,5 millilitri contenenti omogeneati mitocondriali, una serie per il saggio di rilascio MDH e l'altra per la misurazione del ROS mitocondriale. Aggiungere aliquote di fibrille fresche o amiloidi di alfa-sinuleina, insulina bovina o lisozima di uova di gallina all'omogeneato mitocondriale seguito da pipettazione delicata.
Incubare tubi contenenti sospensioni mitocondriali per 30 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 Centigradi. Per il saggio di rilascio della malato deidrogenasi, la centrifuga ha incubato omogeneati mitocondriali a 16.000 G per 15 minuti. Raccogliere con cura i supernaganti risultanti per saggiare l'attività dell'MDH mitocondriale come descritto nella sezione del protocollo parte quarta.
Calcolare il rilascio di MDH come segue. Per la misurazione mitocondriale del ROS, pipetta 191 microliter di omogeneato mitocondriale incubato ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozzetto. Aggiungere quattro microliter di 50 micromolare DCFDA.
Quindi aggiungere cinque microlitri di succinato da 200 millimolare. Incubare il piatto per 30 minuti in bagno d'acqua calda impostato su 30 centigradi mescolando delicatamente. Caricare la piastra in un lettore di piastre a fluorescenza Cytation 5 e misurare l'intensità della fluorescenza in base alla sezione del protocollo.
L'integrità della membrana mitocondriale è stata valutata misurando l'attività dell'MDH nei mitocondri isolati prima e dopo l'interruzione della membrana e il rilascio enzimatico da parte di Triton X-100. Come vedete, in genere abbiamo scoperto che i preparati mitocondriali sono intatti per circa il 93%. Il test di fluorescenza ThT è stato effettuato per monitorare la crescita delle fibrille amiloide.
La curva per la fibrillazione amiloide di tre proteine ha mostrato un tipico modello sigmoidale, raggiungendo un plateau a circa 96, 12 e 96 ore rispettivamente per alfa-sinucleina, insulina bovina e lisozima dell'albume di gallina, suggerendo la formazione di fibrille amiloide che è stata più confermata dalla misurazione AFM. La possibile permeabilizzazione e il danno della membrana mitocondriale da parte delle fibrille amiloide sono stati studiati con il rilascio di MDH mitocondriale e misurazione del ROS mitocondriale. Come vedete nel grafico sinistro, è stato osservato un rilascio sostanziale di MDH dopo l'aggiunta delle fibrille amiloide alfa-sinuleina ai mitocondri.
Mentre un leggero rilascio è stato rilevato dalle fibrille di insulina, le fibrille di lisozima dell'uovo di gallina sono state trovate inefficaci. Il grafico a destra mostra l'effetto delle fibrille amiloidi sul contenuto di ROS mitocondriale. Mentre non è stato osservato alcun miglioramento significativo nel ROS mitocondriale dopo l'aggiunta di lisozima di uova di gallina o fibrille amiloide di insulina, il trattamento con fibrille alfa-sinuleina ha portato a un notevole aumento del contenuto di ROS nei mitocondri cerebrali.
Il presente video descrive uno studio modello per il meccanismo della citotossicità aggregata della fibula a livello di membrana, dimostrando come le fibrille amiloide derivanti da varie proteine possano causare diversi gradi di danno alla membrana e permeabilizzazione. Mentre alcuni argomenti delle fibrille amiloide e della loro specifica membrana legante sembrano fornire la capacità di interagire e causare destabilizzazione e successive perturbazioni delle membrane. Dopo questo video, sarai in grado di indagare l'interazione di forma nativa, fibrillari pre-fibrillari e amiloidi maturi di diversi peptidi e con mitocondri isolati da diversi tessuti o varie aree del cervello.
