我们的协议产生高活性PCD，不含可检测的核酸酶，可用于任何水氧是污染物的解决方案。我们使用的技术易于复制，并确保产品中不存在核酸酶污染物。首先，将一个微升的 pVP91A-pcaHG PCD 表达质粒和 20 微升的商用大肠杆菌 BL21 组合在一个管子中。
轻拂管子混合，将管子放在冰上五分钟。为了继续转化反应，将管子在42摄氏度的水浴中放置30秒，然后在冰上放置两分钟。加入 80 微升 SOC 介质，在 225 rpm 和 37 摄氏度下摇动一小时。
接下来，将转化反应混合物倒入LB-安西林加糖上，并使用板扩散器将混合物扩散。用盖子盖住盘子，在37摄氏度下孵育板16至18小时。之后，从盘子中挑选一个菌落，在250毫升的埃伦迈尔烧瓶中接种50微升的LB-安皮西林。
以 225 rpm 的速度将烧瓶放在摇床上，在 37 摄氏度下孵育 16 至 18 小时。然后，将20毫升的孵育培养基转移到一个四升烧瓶中，里面装满了一升LB-amp机素。在 37 摄氏度下以 225 rpm 转速摇动。
每小时，在光度计上将一毫升培养力绘制成一个培养盒，以600纳米的速度测量光学密度。当培养光密度增加近 0.5 时，将测量频率增加至每 15 分钟一次，直到 OD600 达到 0.5。然后，将四升烧瓶转移到冰箱中。
在冰浴中旋转烧瓶以降低培养温度。在 17 摄氏度和 180 rpm 的温度下将四升烧瓶转移到孵化器中。继续每 20 分钟监控一次 OD600。
在0.7 OD600时，加入IPTG和硫酸铵六氢水合物溶液，最终浓度分别达到0.5毫摩尔和10毫克/升。在 180 rpm 和 17 摄氏度下摇动培养力 18 小时。孵育后，将培养瓶放在冰中两分钟。
在1.5毫升聚丙烯微离心管中收获一毫升诱导细胞，用于SDS-PAGE分析。接下来，将细菌培养剂倒入瓶子中，每瓶500毫升，进行离心。在摄氏4度和3000次g下培养20分钟。
去位超级纳特人。移液器以重新分配颗粒，每粒在12.5毫升的冷PBS中，并在50毫升锥形管中每两个再增射。再次像以前一样将单元格取出。
然后，丢弃超级纳特，并使用移液器在每个管中加入10毫升的解液缓冲液，以重新暂停细胞。用诱导细胞对管子进行声波化后，将细菌酸盐倒入预冷的聚碳酸酯瓶中。在12万次g和4摄氏度的温度下离心60分钟，将上清液倒入一个冷的50毫升锥形管中。
使用镀镍树脂柱制备 FPLC 仪器后，以每分钟 0.15 毫升的速度将样品加载到柱上。用20毫升镍缓冲液用20毫升的镍缓冲液清洗柱。将洗涤液保留在 50 毫升管中进行分析。
接下来，用15毫升镍缓冲液用125毫升的二米多摩尔洗涤柱。收集洗脱在19个分数0.8毫升每个。再次用 15 毫升 100%镍缓冲液 B 洗涤柱，并额外收集 75 分，每个 0.2 毫升。
继续分析 12%SDS-PAGE 凝胶上收集的分数，以确认 PCD 的存在。首先，在1.5毫升聚丙烯微离心管中加入35微升反应缓冲液。在管中，结合峰色谱分数的五微升和 500 纳米的三千基对超焦质质 pXba。
将管子放在37摄氏度的水浴中一小时。根据手稿制备阿加罗斯凝胶后，在凝胶中加入每种反应的30微升。在环境温度下，电泳在 10 伏/厘米下约 1 小时。
现在，橙色的G染料已经到达凝胶的末尾。立即使用荧光扫描仪成像凝胶的溴化乙基信号。利用强度和图像像素大小的功能，确定各种DNA物种的像素体积，如超高、线性和刻痕圆。
要确定每个DNA物种的百分比，请将单个DNA物种的像素体积除以所有单个物种的总像素体积。SDS-PAGE 分析表明，第二个洗脱峰含有最小的蛋白质污染，这表示几乎纯PCD异质剂和最小到检测不到的核酸酶活性。因此，将这两个PCD洗脱的10个分数组合在一个五毫升的圆锥管中，用于进一步分析。
PCD大小排除色谱纯化后，在4摄氏度的冷室中，将微离心管中适当体积的氯化钠、盐酸三氧化三、氯化镁、二硫化物、PCA和超冷质粒pXba组合成5X库存。将 96 孔平底板放在冰上，将 10 微升组合的 5X 溶液转移到油井中。在分析之前，立即向每个井中加入 10 微升的单个 PCD SEC 分数。
将板读卡器设置为 37 摄氏度的内部温度，然后将 96 井板转移到板架上。将板架缩回仪器中，以 20 秒的间隔以 290 纳米为单位测量吸光度一小时。将仪器设置为每次读数前五秒钟摇动板。
一小时后，向每井添加10微升停止溶液以终止反应。对 PCD SEC 分数执行凝胶电泳。选择具有最多 PCA 氧化活性的分数，如吸收率降低和未观察到的核酸酶污染。
测量280纳米的吸光度，根据吸光度和消光系数计算PCD总浓度。将所选分数存放在零下 80 摄氏度下进行长期存储。在这个实验中，发现重组PCD，一种六氯苯二丁标记pcaH和pcaG的异质体，用大肠杆菌表达。
异质首先通过镍亲和力色谱进行纯化。吸收度显示为蓝色，镍缓冲液 B 的浓度百分比显示为红色。流经显示未与镍树脂结合的可溶性细菌蛋白。
一些PCD在125毫摩尔伊米达佐尔的存在下洗清，但大多数蛋白质在250毫摩尔伊米达佐尔中洗清。代表性 SDS-PAGE 分析表明，洗脱步骤中的分数没有污染物。核酸酶测定的阿加罗斯凝胶通过比较与没有添加蛋白质的负对比和被DNA核酸酶污染的阳性对照物来揭示污染。
在阿加罗斯凝胶核酸酶测定中观察到的各种DNA物种的定量显示，29至38的片段几乎没有核酸酶活性，被SEC选择进行组合、浓缩和进一步纯化。按照此过程，纯化的 PCD 可以在所需的氧气清除系统中使用和优化。
这将确定系统所需的 PCD 的确切数量。在单分子显微镜实验中，该技术已用于延长荧光寿命，从而可以延长数据收集时间。使用的超离心量是危险的。
在旋转之前，确保离心机保持适当平衡。溴化钛是一种危险的试剂。穿戴个人防护装备避免接触，并妥善处置。
