本文的目的是提供一个详细的，逐步的视觉协议，从培养的癌细胞中提取水代谢物，以便随后进行代谢分析。该技术的主要优点是它简单可靠，可从粘附细胞中提取代谢物。但最重要的是，它经过了良好的优化，用于使用毛细管电泳-质谱或CEMS的代谢分析。
代谢组学是一种强大的技术，用于识别生物标志物或检测早期癌症和预测化疗对癌症患者的反应。我们在这个演示中使用癌细胞。然而，这种技术也可以用于从其他附体细胞（如 iPS 细胞中的成纤维细胞）中收获代谢物。
代谢物浓度根据可行细胞的数量进行正常化。如此仔细的准备文化，这是获得良好的可重复数据的关键。演示这个程序的将是我实验室的技术人员阿米·丸山。
首先，板HCC827和PC-9细胞在100毫米的盘子含有10毫升的RPMI-1640介质辅以10%的胎儿牛血清。将盘子放在孵化器中，在5%的二氧化碳和37摄氏度的培养下24小时进行培养。孵育后，轻轻倾斜100毫米培养皿，吸气细胞培养培养。
使用两毫升磷酸盐缓冲盐水溶液清洗每道菜上的细胞，不含钙和镁。轻轻摇动每个盘子，使 PBS 溶液完全覆盖盘子的表面，然后倾斜盘子以吸制洗涤缓冲液。温暖 0.25% trypsin-EDTA 溶液至 37 摄氏度。
使用五毫升血清移液器，将两毫升加热的三辛-EDTA溶液添加到每道菜中。轻轻摇动每道菜，使三辛完全覆盖菜的表面。在37摄氏度下孵育培养皿约5分钟。
然后，将预热的完整生长介质的四毫升添加到每道菜中。并轻轻地移液几次，以重新悬浮在中等细胞。将每个电池悬浮液转移到单独的 15 毫升锥形管中。
在800次g下离心5分钟。丢弃上先液，将每个细胞颗粒重新悬浮在预热完整生长介质的两毫升中。将10微升的细胞悬浮液与10微升0.4%的尝试蓝色溶液混合在1.5毫升微管中。
将混合物的10微升加载到细胞计数室中，通过毛细管作用滑动。将腔室幻灯片插入自动单元格计数器，然后按下捕获按钮以捕获图像并显示单元格总数和百分比生存能力的结果。如果总细胞数高于每毫升 50 万细胞，则向 15 毫升锥形管中加入进一步生长介质，以获得所需的细胞浓度。
现在，将培养的培养剂添加到每100毫米细胞培养皿中，每盘大约播种1至2 1/2万个细胞。在37摄氏度下孵育5%二氧化碳的培养皿18小时。首先，在15毫升体积的烧瓶中，稀释含有L-甲硫氨酸磺胺和D-Camphor-10-sulfonic酸1000倍超纯水的商业内部标准溶液。
在超纯水中溶解曼尼托，在超纯水中以每毫升 0.05 克的曼尼托溶液作为洗涤缓冲液。然后，进入每个离心滤芯的滤杯，移液器250微升超纯水。紧贴过滤器单元，在4摄氏度下将离心机在9，100倍g下，5分钟。
检查每个滤物的体积。如果在第一次短旋转期间累积了大量滤物，则过滤单元可能有缺陷。丢弃过滤器单元，改为使用新的过滤单元。
紧闭过滤器单元的盖子，在4摄氏度下以9，100倍g再次离心30分钟。确保任何滤杯中没有超纯水，并用移液器去除每个收集管中的过滤超纯水。将滤杯放回收集管中，并在一小时内使用离心过滤器单元，以避免干燥时损坏。
从孵化器中取出100毫米培养皿，从每道菜中吸出细胞培养培养。在每个盘中加入10毫升PBS培养介质，带或不带250微摩尔二酰胺，注意不要干扰细胞层。在37摄氏度下孵育培养皿30分钟。
孵育后，从每100毫米培养皿中吸出细胞培养培养。稍微倾斜盘子，轻轻加入两毫升5%的曼尼托洗液缓冲液到每个盘子的边缘清洗细胞，注意不要打扰细胞层。从每个培养皿中吸出洗涤缓冲液，然后稍微倾斜盘子并再次清洗细胞，并轻轻添加每盘10毫升的洗涤缓冲液。
然后，从每个培养皿的边缘完全吸走洗涤缓冲液。现在，每培养皿添加800微升99.7%甲醇，并轻轻摇动每个文化菜，覆盖其整个表面。将盘子留在室温下30秒。
通过将移液器的尖端浸入甲醇中，并上下轻轻移液几次，慢慢加入550微升稀释的内部标准溶液。轻轻摇动每个培养皿，以覆盖其整个表面，并在室温下将盘子留在30秒。然后，将提取的溶液从每个培养皿转移到单独的1.5毫升微离心管中。
在4摄氏度下将管子在2，300倍g下离心5分钟。将每个上清液的 700 微升转移到两个离心滤波器单元中，每单位 350 微升。在4摄氏度下以9，100倍g离心，约两个小时，直到滤杯中没有液体。
拆下滤杯，并紧贴收集管的盖子。在这项研究中，HCC827和PC-9细胞平均生长了三个小时。CEMS 分析表明，两个细胞系的二酰胺处理细胞和 PBS 处理的细胞之间存在差异。
其中，五聚磷酸盐通路和上糖解中的几种中间体在二酰胺处理条件下明显较高，而一些三钙循环中间体在治疗条件下较低。细胞内代谢物的代谢图剖面显示HCC827和PC-9细胞中分别有175个和150个差异代谢物。经过二酰胺治疗后，葡萄糖酸和氧化葡萄糖水平在HCC827细胞中增加了12倍，在PC-9细胞中增加了10倍。
同样，第一个六磷酸酶催化糖解产品中的葡萄糖6-磷酸盐水平在HCC827和PC-9细胞中也分别增加了6.3倍和3.5倍。此外，6磷葡萄糖酸盐（磷酸磷通路第一中间体）的含量在HCC827细胞中显著增加89倍，在PC-9细胞中显著增加231倍。相比之下，其他糖解中间体（如果糖6-磷酸盐）的水平在二酰胺实验条件下没有改变。
烟酰胺腺苷总磷酸二聚二胺处理与PBS控制条件之间几乎相等。使用 5%的曼尼托溶液（PBS）作为洗涤细胞的洗涤缓冲液对于 CEMS 分析非常重要，因为盐基缓冲液会干扰分析并对其测量产生不利影响。该协议不适合提取疏水性代谢物，如脂质，因此我们需要开发一个协议，方便提取亲水性代谢物和疏水性代谢物，以便进行更全面的代谢分析。
该技术实现了从几乎任何粘附细胞中轻松提取代谢物，因此适用于癌症、干细胞、药理学、营养学和美容科学等各种研究。
