斑马鱼镜头核定位与功能完整性的评价

我们的协议为镜头发育和生理学的功能研究以及斑马鱼中镜头表型的反向基因筛选提供了一个起点。我们的协议桥接斑马鱼透镜膜形态的体外和体内分析，为斑马鱼透镜光学的定量开发提供了一种新的、直接的方法。分析斑马鱼透镜形态和光学，可以深入了解控制镜头发育、正常生理学和病理生理学的机制。

这些见解反过来又会导致延迟或预防白内障的能力。除了非对称局部透镜核的斑马鱼以外的物种中，没有报告。识别镜头缝合线对于正确定位镜头以测量细胞核定位至关重要。

在确认与三元鱼有足够和解后，使用微解剪刀立即将两只眼睛从成人或幼虫斑马鱼身上切除，并两只眼睛放入 35 毫米定制 Petri 盘中，其中用硅胶解剖模具填充 PBS。要从成年斑马鱼身上采集镜头，请将眼睛后部向上放置，并通过视盘以低于 45 度的角度插入钳子。使用解剖剪刀，使两个或三个径向切口通过视网膜和sclera从光学光盘到固定眼的 Ciliion 区，并剥离视网膜和sclera像花瓣。

将眼睛、角膜侧向上，并使用剪刀的平端，通过操作sclera和角膜间接固定镜头，用钳子拉开视网膜和附着组织，然后小心地修剪掉镜头中多余的组织。为了收获幼虫斑马鱼镜头，将幼虫眼后侧放在PBS硅胶盘的平坦部分，并使用锐化的钨针通过视网膜和硬骨进行径向切口，同时用另一根针或钳子固定眼睛，然后用定制钨丝针的钝侧轻轻地将透镜从分离的眼睛中挖出，并小心地拉开附着的组织。为了测量前轴透镜核的定位，在 PBS 中轴向定向新切除的透镜，用盖玻璃底部与极点和缝合线平行于焦点平面。

要识别镜头核，请查找折射率的差异，折射率通常发生在镜头皮层和镜头核的界面上。如果镜头缝合不明显，稍微舔一下钳子到镜头胶囊就会露出缝合线和镜头核，帮助确定镜头的测量方向。将碟子放在装有摄像头的解剖显微镜的舞台上，并在亮场照明或差分干扰对比度光学元件下对镜头核进行对焦成像。

在同一放大倍数下成像千分尺以进行校准，然后单击"实时视图"。单击快照获取图像并保存图像为 TIFF 文件。要校准采集的镜头图像，请在适当的图像处理软件程序中选择直线工具，并在微米图像上绘制一条已知长度的线。

单击"分析和设置比例"并输入已知距离和单位，然后选择"全局校准"，然后单击"确定"。要测量从镜头核中心到前极的距离，请确定镜头缝合的位置，并使用直线工具以轴向方向绘制穿过镜头核的图像中心。这条线的中心是镜头核的中心。从该点再绘制一条线到镜头前极，并在"分析"菜单中选择"测量"以测量距离。

从前极到后极再画一条线，并测量此距离作为镜头直径，然后将这些长度从"结果"窗口复制到电子表格，并计算镜头核与镜头半径的规范化定位。到受精后三天，前极形成前缝合，通过固定胚胎中狭窄的纤维细胞膜的 phaloidin 染色，可以清楚地显示细胞的惊人收敛。在镜头膜中更强的宽纤维细胞标记局部mApple转基因允许膜亚域的实时可视化，但缺乏分离。

后缝合可以在受精后三天在体外和体内可视化。在赤道平面上，phoidoidin 强烈标记外皮质纤维细胞，露出扁平的六边形。法洛丁被排除在压缩的镜头核和野生类型和突变镜头看起来无法区分。

在透镜膜定位的mApple马赛克转基因中，宽纤维细胞的强标记揭示了突变透镜中细胞体积的中断。由于转基因表达不受渗透性限制，一些马赛克显示透镜核标签。在野生类动物中，镜头核在发育的早期阶段开始靠近前透镜杆，然后在成年后集中。

在转基因宿主中表达绿色标记的蛋白质，其中细胞膜荧光红允许同时进行蛋白质定位以及评估体内的纤维细胞形态。斑马鱼特别适合体内研究。使用此处描述的工具，我们可以探测在体内系统中主要在体外研究的镜头机制。