用于寡核苷酸传递的可生多孔硅纳米粒子的合成、功能化和表征

该协议描述了纳米粒子系统的合成，该系统能够通过高效率地提供siRNA来压制体内的基因。只需交换靶向肽和siRNA有效载荷，富生纳米粒子就可用作需要体内基因调制的疾病的潜在治疗配方。我们之前已经发布了结果，使用熏蒸纳米平台对抗克阳性细菌感染，通过沉默一个基因，编码在巨噬细胞炎症，以终止慢性炎症。

在执行此过程之前，在三对一氢氟酸溶液中组装含有硅晶片的特氟隆蚀刻电池。运行方波形的交流电，低电流密度为 50 毫微米/厘米平方 0.6 秒，高电流密度为 400 毫微/厘米平方，重复 500 次循环 0.36 秒。蚀刻完成后，将细胞从电路中取出，然后用注射器小心冲洗出氢氟酸溶液。

然后，用乙醇冲洗三次。要从硅晶片中提起多孔层，首先用 10 毫升的 1 至 29 氢氟酸溶液填充蚀刻电池的孔。然后，运行每厘米 3.7 毫%的常量，持续 250 秒。

蚀刻完成后，从电路中取出电池。多孔硅层可能有可见的纹波，表明与晶体硅晶片分离。轻轻洗出氢氟酸溶液，然后用乙醇和水冲洗三次。

使用移液器尖端，牢固地裂开多孔硅层的周长，以完成分离。使用乙醇，将多孔硅碎片或芯片从特氟隆蚀刻细胞收集到称重船上。然后，将芯片转移到玻璃瓶中进行储存。

接下来，用两毫升无RNase水代替含有多孔硅片的玻璃瓶中的乙醇。使用 Parafilm 牢固地盖住并密封小瓶。将玻璃瓶放在声波浴中并悬浮，使多孔硅片的体积完全淹没在水浴表面以下。

为防止在声波处理过程中出现重大水损失，请放置一个装满水的体积烧瓶，倒置，使烧瓶的开口接触水浴表面。然后，以 35 千赫的射频功率对多孔硅芯片进行 12 小时的声波化。以 48 瓦的射频功率。声音后，将玻璃瓶放在平坦的表面上一小时，使较大的颗粒在底部沉淀。

然后，使用移液器收集上流水液。在玻璃瓶中，加入72.55微升的DMPC溶液、15.16微升的DSPE-PEG溶液和19.63微升的DOTAP溶液，通过移液混合。将小瓶放在带松动盖的烟罩中，使溶剂在一夜之间蒸发。

干燥的薄膜将是小瓶底部的一种浑浊、坚硬、凝胶状的物质。接下来，在先前制备的冰式声波浴中放置一个含有150微升多孔硅纳米粒子的微离心管。在15分钟的超声波下，将150微升siRNA和700微升的二摩尔氯化钙轻轻移液到多孔硅纳米颗粒中。

从声波器上取出含有一毫升 siRNA 加载的镀钙多孔硅纳米粒子的管子。将宽烧杯装满去维化水。将聚碳酸酯膜和四个过滤器支架漂浮在水面上，浸泡它们。

然后，按照制造商的说明组装脂体挤出套件。接下来，用一毫升的siRNA涂层多孔硅纳米颗粒，在玻璃瓶中水合干脂膜。移液器，直到所有脂质从小瓶底部抬起，并观察到多云，均匀溶液。

在玻璃瓶中加入一个磁性搅拌棒，将小瓶放在热板上，将颗粒加热至40摄氏度，同时以磁性搅拌溶液20分钟。之后，将空注射器连接到挤出机的一侧。然后，将另一个注射器填充一毫升脂涂层多孔硅纳米颗粒溶液，然后将注射器连接到挤出机的另一侧。

开始挤出，缓慢地将活塞推入，将颗粒从一个注射器中推出，穿过聚碳酸酯膜，然后推入另一个注射器。重复20次。然后，将挤压的颗粒收集到微离心管中。

在无 RNase 水中准备具有每毫升一毫克肽浓度的肽库存。在含有富原脂涂层多孔硅纳米颗粒的微离心管中，加入100微升的肽，轻轻移液器。在室温下保持管静20分钟。

为了去除多余的肽或siRNA和其他辅料，在室温下以5000倍g旋转一小时，用30千托离心过滤器清洗。在相同设置下，用一毫升 PBS 多离心机两次。离心后，以所需的浓度在PBS中重新使用最终肽结合的富质脂涂层多孔硅纳米粒子。

这些颗粒可以等分，并在零下80摄氏度下储存至少30天。成功合成富索源多孔硅纳米颗粒应产生一种均匀、略不透明的溶液，可储存30天，并在不引起结构变化的情况下解冻。未能优化比率和浓度，以及重复的冻结解冻循环可能会导致加载时聚合。

当粒子被挤出时，由动态光散射测量的富生多孔硅纳米粒子的平均流体动力学直径应约为200纳米，平均泽塔电位约为正7毫伏。使用靶向肽进行表面改性后，总直径应小于230纳米，平均泽塔电位降至负3.4毫伏。融合可以通过用嗜脂氟化物DII标记富原脂质，并使用共生显微镜观察体外定位来证实。

当富源多孔硅纳米粒子的脂质将DiI转移到等离子膜并独立于晶基进行局部化时，可以观察到成功的融合。不成功的融合将显示细胞细胞质中的DII定位，并和细胞体共同定位。这种富索原纳米粒子系统现在不仅用于细菌感染的治疗应用，还用于癌症辅助治疗和癌症免疫治疗。

此协议可以进一步优化，以加载超过siRNA。富原纳米粒子系统在装载和交付更大的反电有效载荷方面显示出潜力，例如mRNA和CRISPR/Cas9复合物。