细胞调理介质细胞外囊泡的流式细胞学分析

细胞外囊泡越来越多地被用作许多领域的诊断生物标志物和潜在的治疗工具。流细胞测量是描述适合面标记的最直接分析方法，本协议可用于分析一个超大颗粒，速度快，适用于传统的地震仪，无需特殊设置或专用仪器。虽然此协议用于从该条件和介质中对细胞外囊泡进行分类，但它可以扩展到血液到达的AV分类，以取代患者的侵入性组织活检。

对于新进入该协议的研究人员来说，执行设置方法部分中描述的步骤，并密切遵循演示的获取策略至关重要。15分钟后，将盘子和盘子4.4倍10至第五个心脏祖细胞洗到每盘7毫升的伊斯科夫的改性Dulbecco的中、IMDM中，辅以20%的胎儿牛血清和1%青霉素和链霉素，用于在37摄氏度和5%二氧化碳的孵育。当细胞达到约80%的汇合，用Dulbecco的PBS洗两次，不含钙和镁，用10个无血清外体生产介质喂养细胞。

7天后，将调节介质从每个板中放入一个聚丙烯离心管中，并离心介质以清除任何细胞碎屑。将超滤器转移到100千吨离心过滤管中，并通过额外的离心浓缩清除的、有条件的介质。将浓缩物转移到微型离心管中，进行最后的台式离心，并将超薄板加入聚碳酸酯厚壁微离心管。

用PBS填充管，最终体积为3.2米，将样品装入钛固定天使转子中。然后将转子装入桌面超离心，进行超离心，并在 100 微升新鲜 PBS 中重新装入颗粒。对于纳米粒子跟踪和分析定量，在 999 微升 PBS 中稀释 1 微升的超离心样品，然后将样品加载到无气泡的 1 个米莱特注射器中。

将注射器装入检查室的入口口，然后打开激光。使用捕获按钮打开相机，并调整对焦。然后记录至少三个不同的帧，每个帧 60 秒，并使用软件中的批处理选项，分析三个不同的采集。

要准备样品进行采集，首先将适当的实验单克隆抗体结合捕获珠以1:1:1的比例加入微离心管中，然后涡旋产生的捕获珠池。接下来，将适当的样品体积添加到捕获珠池的 1 微升中，以生成 1 倍 10 到 8 颗粒加上 1.2 倍 10 到每个测试浓度的第 5 个珠子。将1微升珠子加入标有磁珠的管子作为负控制，并将每个管中的体积调整为100微升，并配有新鲜的PBS。

然后将管子放入热混合器中，以每分钟 400 次旋转和 4 到 10 摄氏度的速度进行摇动。第二天，将样品转移到圆形底部96井板，并在每个井中加入适当的荧光结合抗体。在4至10摄氏度下孵育1小时后，每井加入100微升PBS，并打开采集软件。

选择细胞仪和系统启动程序，启动仪器并打开新的实验。创建实验模板，并选择板并添加板。选择样品在板上的位置，然后单击设置为样本。

在命名规则中输入示例名称，打开通道选项卡，然后选择适当的荧光信号通道。现在将板装入仪器。然后单击点图，以创建新的向前散点区域与侧散点区域点图。

选择初始化以启动激光和流体，然后单击运行以开始采集。调整刻度以显示前进和侧散射图中间的群体，并围绕整个样本总体绘制一个珠门以排除碎片。单击"停止"和"点"图以创建向前散点高度与向前散点区域点图，并在珠子总体上对样本进行门控。

绘制一个新的门围绕更大的人口和命名它单，并点击点图创建一个荧光信号与侧散点区域点图，每个实验荧光团使用。门点上的单点图。然后选择要记录的事件数，然后选择记录以开始实验采集。

在分析结束时，将采集文件加载到相应的分析软件中，并打开新的协议。为每个文件创建点图（如刚刚演示的），并设置所有散点轴为线性比例，将所有荧光轴设置为日志比例。然后在相关信号通道中显示荧光几何均值，计算不同细胞外囊泡制剂中平均花度强度的全变化。

在测试不同的条件，以设置最小的细胞外囊泡总量，以达到平均荧光强度曲线的早期指数相后，确定最小颗粒数为1倍10至8个颗粒每染色。抗体的最佳浓度为1倍10至8个颗粒，达到无非特异性抗体结合的最高信号，被确定为每毫升10微克，用于抗CD9_FITC和抗CD63_PE抗体，每毫升5微克用于抗CD81_PE抗体。为了确认该方法的适用性，为了分析杯形的细胞外囊泡，而不是膜碎片，对细胞外囊泡进行声波化，在经过30秒的声波后，平均荧光强度降低，在机械中断一分钟后，所有检查都未检测到荧光。

X本身从心脏祖细胞的纯化，如证明，产生细胞外囊泡，表达低水平的CD9和高水平的CD63和CD81从两个细胞群体。此外，虽然 X 自己的表面标记在没有超离心的情况下可以清晰识别，但此浓缩步骤可大大增强这些标记的均度度强度。当处理细胞外囊泡时，很容易错过更粗心的纳米颗粒。

因此，必须遵循协议中演示的所有步骤。使用细胞外囊泡作为生物标志物是目前最新兴的领域研究之一。很快，可以转化为临床诊断用作替代筛查工具。