在异种性鼠模型中的移植-无源疾病的诱导和评分,以及使用数字PCR对小鼠组织中人类T细胞的定量

该协议概述了如何诱导异种移植与宿主疾病，或异种GVHD，以及如何盲目和标准化临床评分，以确保一致的结果。XenoGVHD模型提供了一种体内方法，用于测试针对人类而非穆林T细胞的免疫抑制疗法，从而改进了这些研究的转化过程。演示这个程序的将是阿马拉·森，一个研究生，从我的实验室。

注射前一天，将8至12周大、非肥胖的糖尿病scid伽玛（NSG）小鼠放在灭菌馅饼笼中，并在一个分量为150百分源的铀-137源中照射小鼠，并缓慢旋转以确保均匀的辐照。然后，将老鼠放入无菌生物安全柜中过夜的清洁笼中。第二天早上，收集足够的健康人类血液，每只小鼠分离1.1倍至7个外周血单核细胞（PBMC），并在PBS中以2%的相同体积稀释肝素化血液，即FBS。

在 50 毫升锥形管中小心地将高达 25 毫升稀释的血液覆盖到 15 毫升淋巴细胞分离密度梯度介质上，用于密度梯度离心。在分离结束时，在接口上收获PBMC，并在新的50毫升锥形管中清洗10毫升PBS中的细胞。吸上一液，轻拂管子以松开颗粒。

将 PBMC 重新用 10 毫升新鲜 PBS 重新离心，然后重新用 5 毫升新鲜 PBS 进行计数。然后，用最终离心收集细胞，并在每毫升PBS浓度的1倍10至8PBMC下重新暂停颗粒。为了将分离的人类PBMC的逆轨传递到小鼠眼中，将一个装有28米针的100微升细胞装入一个1毫升注射器。

确认对脚趾捏没有反应，用拇指和中指轻轻约束鼠标。将针斜面向下插入，横向插入中侧手根，通过结膜，直到到达眼部后面。稍微缩回针头，慢慢注射整个细胞体积。

然后，完全缩回针头，以正确处置注射器和针头。关闭眼睑，用纱布海绵对注射部位施加轻度压力。然后，检查注射部位有无肿胀或其他可见的创伤，让小鼠在无菌笼内恢复知觉，并监测，然后再将动物移到其家庭笼子。

要测量 GVHD 分数，请将笼子放在层流罩中，然后从笼子中取出食物和水。要对活动进行评分，请观察小鼠的行为五分钟。要获得减肥分数，请将每只鼠标放在玻璃杯中。

当鼠标仍在烧杯中时，检查动物的姿势、毛皮质地和皮肤完整性。收获感兴趣的组织后，从器官中切出一块约30.5毫米的组织，并在平衡上称量样品。将加权组织转移到无菌的1.5毫升管中，将样品冷冻在液氮中，在零下80摄氏度下隔夜储存。

第二天早上，根据基因组DNA分离试剂盒的指示，在解解前解冻样品。对于通过数字聚合酶链反应（PCR）进行人类T细胞定量，根据用于数字PCR机的DNA结合染料协议准备数字PCR反应，并使用适当的底塑剂用于人类CD3 epsilon基因组DNA。然后，在适当的反应条件下进行数字PCR反应。

与仅接受PBS治疗的负对照小鼠相比，接受人类PBMC的8至12周大NSG小鼠在注射后第10天左右开始显示GVHD的临床症状。异种GVHD小鼠的中位存活期为23.5天。使用数字PCR，CD3 epsilon阳性的人类T细胞可以在接受人类PBMC的小鼠的肺和肝脏样本中检测。

关键是，评分必须始终如一地进行，并且给小鼠打分的研究人员对小鼠的治疗视而不见。按照这个程序，可以从安乐死小鼠身上采集血清进行外周细胞因子表达分析，也可以从脾脏中采集免疫细胞，通过流式细胞学进行分析。