该方法有助于改善蛋白质异构形式和细胞转化后蛋白质的大规模和高分辨率表征。该技术的主要优点是毛细管区电泳质谱仪提供高效分离和高度灵敏的检测完整蛋白质。要预处理毛细管，用氮气在 10 psi 下干燥至少 12 小时。
然后，使用注射器泵将毛细管中 50% 体积的 3 丙基甲基丙烯酸酯填充到甲醇中。用硅橡胶密封毛细管的两端。在室温下孵育至少24小时后，继续在分离毛细管内壁上涂上线性聚丙烯酰胺涂层，如文本协议所述。
使用柔和的火焰燃烧毛细管的一部分，以去除离毛细管一端约四厘米的聚酰胺外涂层。通过擦拭，轻轻清洁毛细管的烧伤部分，以完全去除聚酰胺涂层。在 200 微升管的末端钻一个小孔，其尺寸与毛细管外径相同，一旦毛细管穿过此孔，就足以将毛细管保持到位。
螺纹毛细管的末端，靠近烧伤部分通过孔，直到烧伤部分在管中。然后，在 200 微升管中加入大约 150 微升 HF，使 HF 溶液大约是毛细管上烧伤部分的一半。在室温下孵育HF溶液中的毛细管90至100分钟。
准备标准蛋白质混合物和大肠杆菌样品，如文本协议中所述。要设置毛细管区电泳或 CZE 系统，请将样品、背景电解质和分离毛细管加载到 CZE 自动采样器中。在 CZE 自动采样器的手动控制页中选择样品负载。
将背景电解质小瓶加载到自动采样器的缓冲盘中，注意其在缓冲盘中的位置。然后，将样品小瓶装入自动取样器的样品托盘中，注意其在样品托盘中的位置。使用手动控制将自动采样器置于对齐位置。
现在，使用毛细管的非蚀刻端将分离毛细管加载到 CZE 自动采样器中。如果样品体积小于 50 微升，请调整毛细管喷射端的高度。使用手动控制将自动采样器切换到待机状态。
在系统中键入样品位置，然后将毛细管移动到样品中。将毛细管的喷射端进一步向下推，以到达样品瓶的底部。继续使用手动控制，使用背景电解质冲洗毛细管 20 分钟，压力为 20 psi。
现在，在质谱仪的前面安装一个商用电镀泵护套流接口。在 LCMS 级水中，用含有 10% 体积甲醇和 0.2% 体积甲酸的缓冲液填充护套缓冲液库。通过使用注射器手动施加压力，用护套缓冲液冲洗界面中的 T。
通过套管螺纹电喷雾发射器的一毫米外径端，并通过接头将发射器与 T 的一个端口连接。只需用注射器手动再次冲洗 T，即可用护套缓冲液填充发射器。在接口附带的摄像机的帮助下，将发射器的孔与质谱仪入口之间的距离调整到大约两毫米。
在护套缓冲器小瓶上施加 2 到 2.2 千伏电压进行电喷。然后，调整喷雾电压以达到稳定的电喷。在此过程期间，在毛细管的喷射端施加低压，以确保毛细管中没有气泡。
关闭喷雾电压，通过 T 轻轻将分离毛细管蚀刻端螺纹入发射器，直到无法进一步推。在停止毛细管喷射端的低压后，用护套缓冲器冲洗发射器一点。再次，施加 2 到 2.2 千伏的喷雾电压来测试喷雾。
在主仪器屏幕上的文件下拉菜单下选择新方法。在那里，选择入口作为起始样品小瓶，结束样品小瓶，托盘作为样品，压力为5 psi，千伏为零，持续时间为95秒的样品注射。然后，将进气作为进气瓶，托盘设置为缓冲液，压力为零 psi，千伏为30，持续时间为4，200秒，用于分离标准蛋白混合物样品。
对于大肠杆菌蛋白蛋白组样品的分离，将进气作为入口小瓶，托盘设置为缓冲器，压力为零 psi，千伏为 20，持续时间为 6，600 秒。最后，选择入口作为入口小瓶，托盘作为缓冲器，压力为10 psi，千伏为30，持续时间为600秒毛细管冲洗。现在，使用四离子陷阱掩膜光谱仪设置MS和MS/MS参数，用于完整的蛋白质分析。
要调整调谐文件设置，请打开完整的蛋白质模式并使用 0.2 的陷印压力。将离子传输毛细管温度设置为 320 摄氏度，将 S-镜头 RF 电平设置为 55。要执行 CZE MS/MS 实验，请首先选择运行序列，在质谱仪计算机上启动数据采集方法。
然后，在毛细管电泳自动采样器计算机上启动毛细管电泳序列。在 TopPIC 套件和 TopPIC 图形用户界面中使用 TopPIC 执行数据库搜索。单击数据库文件并选择适当的数据库进行搜索。
单击频谱文件并选择生成的 ms2。作为输入生成的 msalign 文件。选择 MS1 要素文件并选择生成的要素文件。
将半胱氨酸碳基C57设置为固定修饰，由于碘多乙酰胺治疗。选择诱饵数据库功能和截止设置下，在频谱级别旁边的下拉菜单中选择错误发现率。在频谱级别将错误发现率设置为 0.01。
保持生成函数未选中，将误差容差设置为百万分之 15。将错误发现率设置为 0.05 的蛋白质形式级别。在高级参数下，为下拉菜单中的最大质量班次数选择两个。
将未知修改的最大质量移位设置为 500 道尔顿。将所有其他参数保留为默认值，然后单击图形用户界面右下角的"开始"按钮。显示了标准蛋白质混合物的代表性电图。
标准蛋白质混合物通常至少重复运行，以评估系统的分离效率和可重复性。分离效率可以用某些蛋白质的理论板数来评价。可重复性可以通过蛋白质强度和迁移时间的相对标准偏差来评价。
CZE MS/MS 平台可用于在各种复杂蛋白质组中大规模表征蛋白体，在一次运行中以高置信度识别出 500 多个蛋白质和 190 种蛋白质。在这里，电图的放大视图可用于评估系统的分离窗口。极低的E值和光谱FDR表明蛋白质组符号ID的高置信度。 大量匹配的片段离子进一步表明ID的高置信度。
稳定的同位素标记或无标签方法可以纳入CZE MS程序，以确定细胞在各种条件下的蛋白质形式丰度如何变化。该技术开发后，为自上而下的蛋白质组学领域的研究人员探索蛋白质组在调节细胞中各种生物过程方面的作用铺平了道路。不要忘记，使用氢氟酸可能极其危险，执行此程序时应始终采取预防措施，如适当的个人防护设备和应急程序。
