使用 pDawn-Ag43 的高分辨率图案生物膜沉积

我们开发了一种叫做生物膜光刻的方法，将光线照射到表面，细菌会积聚在光的位。这种方法将使我们能够回答生物膜研究中的一些关键问题，例如空间结构如何影响社区功能。这种方法有很多优点。

例如，它工作在25微米的非常高的分辨率，它不需要表面预模式，也工作在封闭的流体器件内。虽然该方法可以洞察天然生物膜的结构-功能关系，但也可以应用于生物膜工程、生物材料和多细胞合成生物学等学科。此方法的可视化演示至关重要，因为在生物膜模式化之前，有关键的初步步骤来准备光学培养装置和细菌样本。

首先，将pDawn-Ag43质粒转化为感兴趣的大肠杆菌菌株，并板到用斑点霉素补充的LB阿加子板上。在培养管中用斑点霉素将单个菌落接种到LB肉汤中，并在250转/小时和37摄氏度的摇晃培养箱中将细胞形成指数级。接种后，在低温管中将一毫升50%无菌甘油与一毫升培养力混合，准备25%的pDawn-Ag43转化菌株的25%甘油。

将库存存放在零下 80 摄氏度的冰柜中。接下来，开始准备光学设置，将便携式投影仪放置在细菌培养箱的底部，孔径直接指向天花板，生物膜培养室将在那里连接。通过显示电缆将笔记本电脑连接到孵化器内的投影仪。

使用胶带将空的虚拟培养皿连接到孵化器的天花板上。通过转动对焦旋钮调整投影机的对焦，使对焦平面与连接到孵化器天花板的生物膜培养盘的底部表面重合。投影机应在文化盘的底部照亮锐利、非模糊的图像。

优化投影后，移除虚拟培养皿。使用便携式计算机软件，通过呈现全蓝色幻灯片，引导投影仪以最大的蓝色照明照亮整个视野。将光电检测器头置于孵化器天花板并读取校准为 460 纳米光波长的相应功率计的强度，使用光学功率计测量投影机的照明强度。

接下来，使用放置在投影仪孔径上的可调中性密度滤波器调整照明强度。旋转滤光片以调整功率计测量的照明强度，直到蓝光投影区域中心的照明强度为每厘米平方 50 微瓦。使用位于培养箱天花板的校准光电探测器确保照明强度设置为适当的水平非常重要。

这允许通过旋转中性密度滤波器对照明强度进行精确调谐。现在，使用笔记本电脑上的演示投影仪软件绘制任意图案，并使用投影仪在孵化器的天花板上显示这些图案。在照明之前，将甘油库存中的 pDawn-Ag43 应变条纹到 LB+规格的加糖板上。

让殖民地在37摄氏度下过夜生长。从 LB+规格汤中的阿加糖板中接种一组 pDawn-Ag43 细菌，并在 250 rpm 和 37 摄氏度的摇晃培养箱中，在一夜之间将培养物生长到静止阶段。第二天，在LB汤中，用斑点霉素以1比1000的比例对培养子进行分维。

允许亚稀释培养物在6小时以250转/时和37摄氏度的速度在摇晃的培养箱中生长，直到后期指数、早期静止阶段。在照明之前，对隔夜文化进行回稀释并增长到晚指数阶段非常重要。这可确保细菌在诱导时可靠健康和活性。

孵育后，以1比100的比例对晚期指数期培养，用先前准备的M63培养剂辅以每毫升50微克的亚丁霉素。然后，将稀释引入生物膜培养皿中。由于样品现在已准备就绪，请将培养皿贴到培养箱的天花板上，确保培养皿底部的表面透明，以便由投影仪从下方进行照明。

生物膜样品过夜生长后，从培养箱中取出培养皿。该盘将有生物膜细菌连接到其底部表面，它已被照亮，以及浮游生物细菌分散在上面的液体介质。从培养皿中去除液体介质，丢弃浮游细胞。

接下来，用PBS冲洗样品两次，通过轻轻移液在PBS中去除剩余的浮游细胞，然后吸气。如果细胞被荧光标记，则使用荧光显微镜直接对样品进行成像。如这里看到的，pDawn-Ag43细菌被用来产生生物膜模式在聚苯乙烯井板与投影仪照明。

生物膜可以使用水晶紫罗兰染色或荧光显微镜（如果使用荧光细菌）进行可视化。荧光生物膜样品也可以使用共生显微镜进行成像，以3D获得生物膜的图像。通过使用胶片光掩膜为生物膜样品提供图案照明，可以进行高分辨率图案化。

此处显示了玻璃和 PDMS 表面上的图案示例以及封闭的 PDMS 培养室，并说明了可以应用 pDawn-Ag43 图案的不同类型的环境。在尝试此过程时，首先将 pDawn-Ag43 转换为您感兴趣的应变，然后正确聚焦和校准投影机，最后按照所需的培养和背稀释步骤进行心理测试，为细菌的照明做好准备，这一点很重要。按照这种方法，可以部署其他技术，例如，在不同的培养条件下长期监测生物膜。

这样，我们可以理解生物膜结构如何影响其功能。这项技术将广泛应用，例如，用于合成生物学和材料研究，用于设计生物膜的各种应用。