龙苷受体 n 端域的晶体结构

解决瑞安碘受体域的结构有助于我们了解蛋白质功能的分子机制、杀虫剂作用和杀虫剂耐药性的发展。这一措施意味着使用X射线晶体学进行结构图示，这被认为是以近原子分辨率测定蛋白质结构的黄金标准。这种昆虫Ryanodine受体域的高分辨率结构揭示了通道门控的机理，为利用基于结构的药物设计方法开发物种特异性杀虫剂提供了重要的模板。

一般来说，对这种方法的新鲜人会很吃苦，因为未来的蛋白质晶体学家必须精通生物化学、生物物理学、计算机科学和数学。首先通过聚合酶链反应放大与感兴趣的蛋白质对应的DNA。在反应结束时，在2%的阿加罗斯凝胶上运行整个50微升的反应混合物，然后根据标准协议用凝胶提取试剂盒提取DNA。

接下来，在30微升双蒸馏水中，将20微升的载体DNA与6微升10倍反应缓冲液和4微升SSPI限制酶混合，使LIC载体DNA线性化。在37摄氏度下孵育这种反应混合物3小时。在孵化结束时，在1%的阿加罗斯凝胶上运行整个反应混合物，然后根据制造商的说明使用凝胶提取试剂盒提取线性化载体DNA。

接下来，根据标准协议，对线性化载体DNA和PCR放大插入DNA的5微升进行独立的T4 DNA聚合酶处理。在室温下孵育40分钟，随后在75摄氏度下孵育20分钟的酶热灭活。通过将 T4 处理的 2 微升插入 DNA 与 T4 处理 LIC 载体 DNA 的 2 微升结合，在室温下孵育 10 分钟，执行与结扎无关的克隆退火反应。

将BL21（DE3）大肠杆菌与重组质粒进行转化，在冰上解冻50微升的称职细胞，并将约1微升的退火质粒加入管中。轻轻轻拂管子两到三次，将细胞和DNA混合，将管子放回冰上20分钟。

在孵化结束时，在42摄氏度的温度下热击细胞40秒，然后回到冰上两分钟。接下来，在管中加入一毫升室温 LB 介质，在 37 摄氏度下将细胞放在 250 RPM 摇床上 45 分钟。在震动孵育结束时，将这种混合物的150至200微升板放入选择板，并在37摄氏度下将板在37摄氏度下过夜。

第二天，在37摄氏度的摇床孵化器中，在100毫升的2-YT介质中培养一个群体，辅以卡那霉素。第二天早上，接种一升2-YT介质，辅以卡那霉素，10毫升过夜培养，并在37摄氏度下孵育，摇晃，直到OD600读数达到约0.6。然后，诱导与IPTG培养物最终浓度为0.4毫摩尔，并在30摄氏度下生长细胞5小时。

在孵化结束时，通过离心收获细胞，并每40毫升的解液缓冲液浓度将颗粒重新悬浮到10克细菌。以 65% 振幅的声波破坏细胞壁，在一秒关闭一秒时中断细胞壁，8 分钟。通过离心去除细胞碎屑。

然后，通过 22 微米过滤器过滤上清液，然后将溶液加载到样品循环中。为了净化融合蛋白，将样品环中过滤的上清液注射到纯化系统中的5毫升镍-硝基色色柱中，其线性梯度为20至250毫摩尔。用烟草蚀刻病毒蛋白酶分离的分离目标蛋白，以1-50的比例，在4摄氏度过夜，并纯化了阿米洛塞树脂柱上的裂解反应混合物和镍硝基蛋白柱，去除标签和烟草蚀刻病毒蛋白酶。

将透析缓冲液从镍-硝基色柱中透析的流经中解入，以降低盐浓度，并在洗脱缓冲液中用20至500毫摩尔氯化钾的线性梯度净化苯乙烯交换柱上的样品。然后，将蛋白质浓缩在离心浓缩器中。将浓缩蛋白注入 Superdex 200 26/600 凝胶过滤柱，以检查均匀性，并评估蛋白质的纯度 15%SDS-PAGE。

为了准备结晶的蛋白质，将纯化蛋白质样品浓缩到离心浓缩器中每毫升10毫克，并在80摄氏度储存前将缓冲液交换到结晶缓冲液中。要进行结晶筛选，请使用 295 Kelvin 的坐滴蒸汽扩散方法，并采用多个结晶套件，以及 96 井格式的自动液体处理系统。在落液设置结束时，密封 96 井结晶板以防止蒸发，并实现储液罐缓冲液内蛋白质滴的均衡。

将板放在 18 摄氏度的晶体培养箱中。在光学显微镜下定期检查板，以监测晶体的形成和生长。为了将蛋白质晶体与盐晶体区分开来，在目标滴中加入一微升蛋白质晶体染料，并在一小时后在显微镜下观察晶体。

蛋白质晶体会出现蓝色。为了进一步优化晶体，在24孔板中采用正结晶条件和悬挂滴蒸汽扩散法，随后在18摄氏度的晶体孵化器中孵育。要确定蛋白质结构，请将晶体安装在光显微镜下，用于液氮中的闪光冷却，然后将晶体放在单桶中进行储存和运输。

在内部 X 射线衍射器中预筛选晶体，使用手动居中功能安装和居中晶体。然后，使用 X 射线衍射软件收集数据。要索引、集成和缩放数据集，使用 HKL-2000 套件，首先选择探测器并加载数据集。

然后，执行峰值搜索功能，查找衍射点。索引点，选择正确的空间组，并执行峰值集成。接下来，缩放数据集。

调整错误模型并再次缩放。保存输出 sca 文件。若要使用 Phenix 软件套件确定结构，请创建一个新项目。

首先，使用 sca 文件运行 Extriage，以计算非对称单元中蛋白质分子的可能拷贝数。其次，通过分子置换、运行相位器解决相位问题，利用衍射数据文件、具有高序列标识和结构相似性作为目标蛋白的模板结构文件以及蛋白质序列文件，找到解决方案。使用 Phaser 的输出文件和目标蛋白质的序列文件，在 Phenix 中执行自动构建以生成初始模型。

使用COOT手动将结构构建成经过修改的实验电子密度，并使用 Phenix 在迭代周期中细化。使用 Phenix 中的验证工具验证最终模型。在这个具有代表性的实验中，通过STS-PAGE分析，对金刚背飞蛾ryanodine受体蛋白的终端域的纯化，通过STS-PAGE分析，产生了一个带，大约21千吨。

凝胶过滤柱的洗脱体积确认纯化的ryanodine受体终端域为单体。对于结晶，形成高质量板状晶体的最佳条件是在存在1个pH值为7的摩尔 HEPES 和1.6个硫酸铵。通过演示的衍射数据集对蛋白质结构的测定揭示了覆盖残留物1至205的金刚背飞蛾ryanodine受体终端域。

具有大紊乱、灵活区域或弱亲缘的蛋白质很难结晶。在这些情况下，蛋白质工程策略，如表面熵减少，循环截断和交叉链接，可能会增加获得更好的蛋白质晶体的可能性。除了揭示高分辨率蛋白质结构外，X射线晶体学还可用于研究蛋白质-农药相互作用，这可能有助于基于结构的农药设计。