用于玻璃化和变暖步骤中囊胚行为客观评估的形态学协议

该形态化协议允许在之前的玻璃化干预和预热后恢复期间监测囊肿收缩和再膨胀的强度，并提供对病毒玻璃化方法有效性的见解。该技术的主要优点是，它可以应用于配备延时显微镜的体外受精实验室和配备高级图像编辑软件的计算机。在扩张的第五天或第六天，对至少几个内细胞质量细胞和有凝聚力的肌萎缩球体进行冲击，形成0.4至0.7毫秒的激光脉冲，孔径从4.3到9.4微米不等，切线对着佐纳佩图西达和两个相邻的三角细胞的交界处。

然后，让爆震完全或部分坍塌五分钟。接下来，使用一个微小的移液器，无菌地将平衡介质添加到九孔培养皿微滴区域的孔中，专为延时显微镜和记录而设计。添加所有介质后，用大约 30 微升的平衡介质覆盖微滴区域。

将激光处理的爆震淹没在微滴盘一个微滴孔底部的平衡介质中。一旦转移了爆震，开始倒计时计时器 10 分钟。并在配备相机的显微镜的舞台上转移微滴盘。

使用 200 X 放大倍率，调整微滴盘，使爆震位于录制窗口的中心。然后，开始使用显微镜记录软件进行录制，并记录开始录制的倒计时时间。为了储存胚胎，将胚胎装入玻璃化吸管后，密封吸管，并在装载80至110秒之间将吸管放入液氮中，然后将胚胎置于负196摄氏度。

要测量在平衡阶段监测的囊肿的横截面区域，请将快速选择工具标记定位在囊肿内，直到它接触囊肿的边缘，并反复单击并按住鼠标左键来勾勒出囊肿的外缘，直到选择囊肿的整个横截面区域。然后，在时间线窗口中，单击测量日志并记录测量结果。对于气囊再膨胀，快速将带玻璃化爆氧的 HSV 吸管从存储转移到充满液氮的便携式储液罐中。

并使用钳子将吸管抬得足够高，以暴露彩色处理杆。使用自调节线剥离器在彩色处理杆的高度切割吸管。并迅速控制运动，从吸管中提取处理杆。

立即将处理杆的弯曲铲入 37 摄氏度解冻溶液的容器中。轻轻旋转处理杆以分离囊肿。一分钟后，用连续四分钟的浸入和稀释溶液清洗囊肿。

洗涤溶液一，洗涤溶液二。接下来，将加热的气囊转移到含有新鲜恢复介质的四孔盘中，并使用移液器在所有三滴介质中清洗气囊。上次洗涤后，将爆震转移到九孔延时盘中，含有恢复介质。

将九井盘放在延时相机下，在37摄氏度、6%CO2和5%O2培养箱中。现在，打开延时录制软件并选择一个录制摄像机。选择实时模式，将光标放在图像上。

滚动以放大图像，并使用鼠标左键将包含爆震的井放在屏幕中间。在对焦下，使用箭头对焦爆囊的录制平面，并在光强下设置图像的光强。单击显微镜参数以设置曝光时间和伽玛，然后单击关闭实时模式。

单击"开始项目"以输入项目数据。选择培养盘类型并取消选中除要记录的位置以外的所有位置。然后，将捕获时间设置为每五分钟拍摄一张照片，然后单击"批准"以记录爆炸囊重新扩展至少 150 分钟。

在这个代表性，持续监测，完整的胚胎，完整的胚胎没有完全崩溃的平衡溶液和重新膨胀到约70%的原始大小，经过10分钟的接触平衡溶液。相比之下，这种人工折叠的爆震在激光治疗后立即被完全清空，在接触平衡溶液的10分钟内未观察到显著的重膨胀。在使用含高浓度的低温保护物的玻璃化介质进行处理后，这种平衡的完好爆炸菌经过了一步逐步减少的爆炸。

变暖后，在接触恢复介质后，它再次膨胀。然而，这种激光脉冲爆震表明，用激光处理时，爆炸孔立即坍塌，在平衡或玻璃化步骤中未恢复，这就使对坍塌的囊肿进行如此长的平衡阶段的必要性提出了质疑。该协议还使人们深入了解了在变暖后，囊肿能够恢复爆炸。

例如，在变暖后重新膨胀的爆震可以是线性的，也可以被几个更大或更小的收缩打断。在尝试此过程时，重要的是要记住，在录制过程中，胚胎必须保持在培养皿的底部，尽可能少的时间。不要忘记，高浓度的低温保护物对胚胎有毒。

每次开发后，该技术为低温生物学领域的研究人员在体外受精程序中探索低温保存方案的有效性铺平了道路。