全完整型小鼠软骨外种机械负荷对软骨细胞损伤的实时可视化与分析

这种方法能够调查不同机械载荷方案、环境条件或软骨退化阶段对原位关节软体细胞脆弱性的影响。物理力。与其他技术不同，这些测量是在完全完整的软骨中实时进行的，同时不影响原生边界条件。

这项技术的另一个优点是它使用小鼠模型，允许测试特定基因如何影响原位软体细胞在机械损伤中的易感性。对于深骨股骨的解剖，将鼠标放在超活位置，并在膝盖前部进行五毫米的皮肤切口。将切口一直伸到膝盖周围。

并拉回皮肤暴露膝盖关节和腿部肌肉。从股骨的近端开始，使用11号手术刀刀片沿远端方向切割骨骼。将刀片定位在四头肌肌腱单元和股骨轴前侧之间。

将切口伸过帕泰拉。切穿肌腱中间切掉四头肌肌腱单元。接下来，从股骨的近端开始，将手术刀刀片定位在腿筋肌肉肌腱单元和股骨轴的后侧之间，并沿着骨骼沿远端方向切割。

当切口接近膝关节时，切开软组织，完成膝盖关节的切口。拉回四头肌和腿筋肌肉，露出股骨。切掉骨的侧侧和中侧多余的肌肉。

切开近端侧小腿肌肉。翻转腿以可视化股骨的后侧。取出膝关节周围的多余的组织，露出股骨和近侧头骨的后表面的侧孔。

切开前十字韧带和后十字韧带，远离股骨。将头骨从股骨上拉开，切开所有韧带，将小腿与股骨分开。使用标准的解剖剪刀，从侧侧切穿骨骼近端的股骨，比侧侧骨关节高出约八毫米。

并使用珠宝商的钳子从股骨上去除周围的软组织。然后将软骨暴露在股骨端端的两个圆锥体上。定期用HSSS水合关节表面。

对于腐殖质的解剖，请将鼠标放在超活位置。用微型剪刀在肘部后侧做五毫米切口。伸展肘部周围的切口，拉回皮肤，露出手臂和肩部的肌肉。

从腐殖质的近端开始，将十一号手术刀的刀片在三头肌肌腱单元和腐殖质的后侧之间放置。沿着骨头沿着小方向切开。通过三头肌肌腱向腐殖质的端端延伸切口，将三头肌拉回腐殖质的近端，直到腐殖质头部暴露。

在不接触关节表面的情况下切割腐殖质头部周围的结缔组织。从身体里取下肢体用HSSS水合腐殖质头的关节表面。

要断开腐殖质与手臂的连接，请使用钳子切断手臂后侧的 ulna 的近端。切开腐殖质端周围的结缔组织，去除骨骼上多余的组织。然后使用标准解剖剪刀去除腐殖质后侧的三叶虫管。

将解剖的标本放入含有HSS的1.5毫升微离心管中。对于样品的钙素 AM 染色，将骨骼转移到 HBSS 中含有 500 微升的 10.05 微摩尔钙化物的 1.5 毫升微离心管中。在 800 rpm 时将管以 37 摄氏度的高温混合器中放入热混合器中，防止光线。

三十分钟后，用新鲜的HBSS清洗标本十分钟。将试样转移到安装在定制显微镜的玻璃幻灯片上，安装机械测试装置，使后股心结的关节表面或腐殖质头部坐在玻璃上。使用 HBSS 使试样水合，将带试样的设备置于荧光显微镜阶段。

在负载应用之前，在 4 倍放大下对沾有钙素 AM 的关节软骨细胞进行成像。调整采集设置以优化图像质量。要施加静态机械载荷，请将规定的静态负载放在试样顶部，以便将关节软骨压缩在盖玻璃上五分钟，然后拆下负载。

要施加冲击机械负载，请从规定高度将已知重量的圆柱形冲击器滴到试样上，在撞击后五秒钟释放负载。去除任一负载后，立即在一毫升HSS中孵育新准备的60微摩尔丙酸碘化物中的标本。在室温下五分钟，然后通过荧光显微镜重新成像关节软骨细胞，正如刚刚演示的。

为了量化由于应用机械载荷方案而导致的损伤细胞和死亡细胞的面积，首先打开在 ImageJ 中应用机械载荷之前和之后获得的关节表面的显微图。将图像合并到堆栈中。根据图像分辨率设置图像比例。

接下来，定义细胞成为钙素阴性且PI阳性的区域。这些细胞被认为是受伤或死亡。然后使用测量工具确定受伤死细胞的面积。

至少有六个测试应用了加载协议，在股骨和腐殖质的骨质损伤中可重复诱导可量化的局部区域，从8至10周大的瓣膜C小鼠获得。在测试的所有加载协议中，更高的负载幅度和更高的冲击强度显著加剧了股骨和腐殖质细胞损伤的种族程度。执行解剖时，必须记住不要与手术工具接触关节软骨，因为这可能通过标本的能力而损害基线。

使用这种镜像模型可能有助于骨关节炎的研究，因为这种疾病很容易通过遗传、饮食或手术操作在小鼠中诱发。我们的平台还提供一个工具，用于询问基础科学问题，并针对软细胞的机械脆弱性筛选治疗干预措施。