超高分辨率小鼠光学相干层析成像辅助眼内注射在视网膜基因治疗中的应用

此下视网膜注射程序的总体目标是以可实时观察到的微创和可重复的方式向视网膜提供载体。你好，该方法可用于回答基因治疗研究中有关载体传递疗效和治疗剂毒性的关键问题。该技术的一些优点包括对视网膜和其他眼睛结构的最小损伤，精确的注射部位映射，以及严格的定量体内测量，允许坚实的统计推理。

对于眼内转基因注射，首先将麻醉小鼠置于视网膜成像系统显微镜的观察阶段，将无菌钝虹膜钳的尖端置于眼睑的七点和十点钟位置，同时将钳子打开和向下，以轻轻诱导促进性。使用钳子哄骗眼球下的眼睑，并引导针尖到角膜边缘以下约 1 至 1.5 毫米。接下来，将一滴无菌 PBS 溶液涂抹在眼睛上，用无菌盖滑盖住眼睛。

小心地将针头通过结膜驱动到眼睛中，直到制造下性凹陷。使用微型操纵器向上旋转眼睛，直到眼部凹陷对焦，然后向前驱动针头，用针头在视网膜中形成一个尖锐的峰值。使用针架旋转针头，直到针头尖通过硬合体和RPE孔，使针尖中的面粉素在靠近下视网膜空间和视网膜色素的上皮细胞单层下的视网膜组织下可见。

向下驱动针尖，使针尖与地球切线，然后用脚踏板开关激活喷射泵。在将0.5至1微升的转基因溶液送到亚中心空间后，取出针头并确认血液稳定，且液体不会从注射液部位泄漏出来。要确认注射成功，请记录一个矩形卷 OCT，并将图像与不同类型的潜在注射结果的图像进行比较。

确认正确注塑放置后，使用该矩形 OCT 图像将 bleb 的范围映射到基金图像上。要映射下一个模糊的范围，请打开 bleb 的矩形体积 OCT 图像，以便图像中包含眼睛中的可识别地标。添加尽可能多的卡钳，以识别 B 扫描的左右边缘的位置，以及视神经头 ONH（如果存在）以及视网膜从 RPE 和 choroid 分离，然后保存数据的拐点。

然后编译保存的文件并绘制数据，有效地将注射 bleb 的映射创建到 en face OCT 图像上。将绘制的数据叠加到包含注入站点的基金图像上，并保存合并的图像。使用此图像可查找后续 OCT 成像期间感兴趣的区域。

要评估注射后视网膜退化，请首先打开记录的高分辨率光谱域 OCT 或 HRSD OCT 矩形体积图像，然后选择要测量的 B 扫描。放大所选图像，直到其填满屏幕并右键单击图像。单击卡钳以选择适当数量的卡钳，然后使用配置卡钳功能将卡钳指定为角度块列中的垂直卡钳，并打开显示卡钳位置，以便于在视网膜上均匀放置卡钳。

单击应用并移动每个卡钳，在 B 扫描中相隔 0.1 至 0.2 毫米，小心在适当时将一个卡钳放入视神经头中心。放置所有卡钳后，单击每个卡钳并将其拖动到感兴趣区域的长度跨度，任意设置卡钳，不会将 B 扫描的可测量区域叠加到最大长度。要测量外层厚度，请将每个卡钳的顶部放在外部限制膜上，将每个卡钳的底部放在外层底部，在视网膜上以 0.1 到 0.2 毫米的增量。

放置并调整所有卡钳大小后，右键单击图像并单击保存卡钳数据"，然后重复每十次 B 扫描所演示的测量值，使卡钳保持打开，并在 x 轴上的相同位置，并根据需要调整卡钳的长度，而无需在 x 方向上移动卡钳。测量所有扫描后，打开保存的数据文件并单击修改日期"，以便根据保存的时间排列文件。打开每个 B 扫描的所有文件，将每个 B 扫描的原始数据编译为从最低到最高帧数的单个文件，然后选择数据列，包括卡钳名称、长度和中心 X 列。

确保对于处理的每个矩形卷 OCT 图像测量的所有 B 扫描中心 X 相同，并删除未用于记录测量的卡钳中的任何数据。将位于视神经头中心的卡钳设置为零，并绘制 X 数据集与多个 Y 数据集的数据，以获得外部核层或任何其他测量视网膜层的厚度的 3D 绘图函数。然后比较控制和实验动物与相应年龄之间的外部核层测量，以确定任何潜在的视网膜退化的速率和均匀性。

对于视网膜测量的 3D 映射，请查看注射后 OCT 图像并记下任何可识别的地标，然后定位动物以从同一区域获取后续 SDO CT 图像，注意包括相同的可识别地标，并像刚刚演示的一样处理记录的图像。获得高质量的 OCT 图像（包括可识别的地标）非常重要，以方便重新成像以前注入的视网膜区域。为了测量操作系统长度的变化，卡钳从外部限制膜放置到布鲁克斯膜，从而允许可靠的测量，因为这些层在 OCT 图像中很容易识别。

这些层之间不同鼠标线的测量值差异归因于较短的外部段长度。如果成功执行下重注入，则下一个空间的打开会产生一个 bleb，该 bleb 可以在 HRSD OCT 成像器的 en 面视图和 B 扫描图像中清晰可视化。叠加注射部位的边界图允许分割视网膜组织测量和卡钳位置数据集，以便随后对特定治疗剂对视网膜退化的影响进行统计测试。

一旦掌握，这项技术可以在十分钟内完成，如果执行得当。在尝试这个程序时，重要的是要记住保持手术环境清洁和无菌。该技术开发后，为基因治疗领域的研究人员实时监控整个下体手术注射过程铺平了道路，并创造了一种立即确定体内手术成功的方法。

按照此注射程序，可以执行 OCT 和其他方法，如电视网膜学，以回答有关转基因功能救援和/或毒性的其他问题。观看此视频后，您应该了解如何执行跨细胞和转义体下视网膜注射，如何从此图像将注射出血的范围映射到 OCT，并获得外部视网膜层的严格测量。不要忘记，使用基因治疗载体可能是危险的，并且在执行此程序时应始终使用预防措施，例如佩戴适当的个人防护设备。